朱砂七總蒽醌對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖和凋亡的影響

趙 勤 趙 銘 盧 健 衛(wèi) 昊 郭惠玲

(1.陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712046； 2.咸陽市中心醫(yī)院，陜西 咸陽 712000)

朱砂七，為蓼科植物毛脈蓼Polygonumciliinerve(Nakai)ohwl.的塊根，為“太白七藥”之一，天然資源十分豐富。其味苦，性涼，能清熱解毒、止痛止血，主治扁桃體炎、胃腸炎、尿路感染等感染性疾病。近年來我們研究發(fā)現(xiàn)朱砂七總蒽醌具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗病毒的作用，并對多種腫瘤具有抑制和促進(jìn)其凋亡的作用[3-8]。但是關(guān)于朱砂七總蒽醌對于人肝癌抗腫瘤效果未見有報道，作用機(jī)制也不清楚，為此我們選擇人肝癌SMMC-7721細(xì)胞從體外對其抗腫瘤作用進(jìn)行研究，并初步探討了其抗腫瘤的可能機(jī)制，以期為朱砂七總蒽醌抗肝癌奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1藥品

朱砂七總蒽醌(ZSQ，由本實驗室提取)，溶于無血清的DMEM培養(yǎng)液中配成64 mg/ml的儲存液，分裝，4℃保存。

1.2主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)；EDTA、EB、PFA、檸檬酸鈉(國產(chǎn))；MTT、蘇木精、伊紅(Sigma公司)；四氮哇鹽(MT)和二甲基亞礬(DMSO)，Sigma公司；TUNEL試劑盒(Roche公司)；CO2培養(yǎng)箱(3111型，美國)；酶聯(lián)免疫檢測儀(DG-5031型，國營華東電子管廠)；分析天平(A120S型，德國)；凈化工作臺(ZYJ-L型，富康集團(tuán)安泰公司)；倒置顯微鏡(XDS-1型，重慶光學(xué)儀器廠)。

1.3瘤株和細(xì)胞株

SMMC-7721細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞株)由第四軍醫(yī)大學(xué)口腔生物實驗室提供。

1.4實驗方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng) 將人SMMC-7721細(xì)胞株復(fù)蘇后，用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳代，取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期的細(xì)胞實驗。

1.4.2MTT法測定朱砂七總蒽醌對SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響 取對數(shù)生長期的SMMC-7721細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度3×104個/ml接種于96孔培養(yǎng)板中，100 μl/孔，培養(yǎng)24 h后分別加入32，3.2，0.32，0.032 mg/ml 濃度的朱砂七總蒽醌藥液，另設(shè)空白對照組和細(xì)胞對照組，每個濃度設(shè)4個復(fù)孔。37℃，5% CO2培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，實驗結(jié)束前4小時每孔加入MTT(5 mg/ml)20 μl，37℃，5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸去上清液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min使甲攢完全溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長下測各孔吸光度(A值)，按下列公式計算細(xì)胞增殖抑制率。抑制率(%)=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.4.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 將對數(shù)生長期的SMMC-7721細(xì)胞調(diào)整為1×105個/ml，接種于50 ml培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h后，加入終濃度分別為0.32，3.2，32 mg/ml的朱砂七總蒽醌藥液，空白對照加等量的培養(yǎng)液；37℃，5%CO2，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，PBS漂洗，滴片，自然晾干；用甲醛固定，蘇木素和伊紅進(jìn)行HE染色，乙醇脫水、二甲苯透明，以樹脂封片，顯微鏡下觀察并照相。

1.4.4TdT酶介導(dǎo)的原位末端標(biāo)記法(TUNEL)觀察 試劑盒為Roche公司產(chǎn)品，按其說明書操作。取對數(shù)生長期的SMMC-7721細(xì)胞，調(diào)整其密度為1×105個/ml接種于有蓋玻片的12孔培養(yǎng)板上，24 h后分別加終濃度為32，3.2，0.32 mg/ml的朱砂七總蒽醌藥液，空白對照加等量的培養(yǎng)液；37℃，5% CO2，培養(yǎng)48 h后，將吸附細(xì)胞的蓋玻片用4%多聚甲醛室溫固定30 min，0.5% H2O2甲醇溶液滅活內(nèi)源性過氧化酶，0.1%TritonX-100 4℃滲透2 min，沖洗，待玻片干后，每張玻片加30 μl的TUNEL反應(yīng)液，37℃孵育30 min，沖洗后再加入30 μl的Coverter-POD液，37℃孵育30 min，PBS沖洗，滴加100 μl DAB顯色液，室溫避光顯色10 min。蒸餾水沖洗，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察并照相，DAB顯色后凋亡細(xì)胞呈棕褐色，高倍鏡下記數(shù)凋亡細(xì)胞，計算凋亡率。

2 結(jié) 果

2.1朱砂七總蒽醌對SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響 MTT實驗結(jié)果顯示，經(jīng)朱砂七總蒽醌分別處理SMMC-7721細(xì)胞24 h、48 h和72 h后，A 值分別比未經(jīng)處理的SMMC-7721細(xì)胞顯著下降(P<0.05，P<0.01)，對細(xì)胞增殖的抑制率隨著劑量的增加和時間的延長顯著升高，見表1。

表1 朱砂七總蒽醌對SMMC-7721生長的影響

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2朱砂七總蒽醌對SMMC-7721細(xì)胞的形態(tài)學(xué)影響 HE染色后，在倒置顯微鏡下觀察：正常對照組的SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)完整，胞膜胞核完整，胞漿豐富、未見明顯的細(xì)胞聚集；經(jīng)朱砂七總蒽醌處理過的SMMC-7721細(xì)胞皺縮，胞漿稀少或缺乏，細(xì)胞質(zhì)染成粉紅色，細(xì)胞核固縮、碎裂、染成藍(lán)紫色，細(xì)胞核固縮碎裂成數(shù)個圓形顆粒，出現(xiàn)凋亡改變，凋亡小體形成。32 mg/ml組核染色消失，呈均質(zhì)紅染的無結(jié)構(gòu)形態(tài)，結(jié)果見圖1。

圖1 SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)過48 h培養(yǎng)的HE染色結(jié)果

2.3TUNEL 法檢測朱砂七總蒽醌誘導(dǎo)SMMC-7721 細(xì)胞凋亡 SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)朱砂七總蒽醌32，3.2，0.32 mg/ml三個劑量分別處理48 h后，均出現(xiàn)棕褐色的凋亡細(xì)胞染色陽性顆粒，尤其32 mg/ml劑量下，細(xì)胞核固縮成棕褐色濃染的凋亡小體，鏡下計數(shù)，凋亡細(xì)胞百分率分別約為62.1%，25.8%，14.50%，且隨作用濃度增加而增加，而空白對照組為0.50%，見圖2。

圖2 SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)過48 h培養(yǎng)的TUNEL檢測結(jié)果

3 討 論

本實驗以人肝癌SMMC-7721細(xì)胞為靶細(xì)胞，研究了朱砂七總蒽醌對SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明，朱砂七總蒽醌具有明顯抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖的作用，抑制率最高可達(dá)到83.82%，且其抑制作用呈明顯的劑量和時間依賴關(guān)系。為探討其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用是否和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)，我們通過HE染色從形態(tài)上觀察到朱砂七總蒽醌處理過的SMMC-7721細(xì)胞皺縮，染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞核固縮碎裂成數(shù)個圓形顆粒，凋亡細(xì)胞形成且數(shù)量較對照組增多, 表明朱砂七總蒽醌可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。由于HE染色結(jié)果只能定性, 不能定量, 因此我們進(jìn)一步采用TUNEL法對凋亡細(xì)胞進(jìn)行定量分析。TUNEL法是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法, 對完整的單個凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色, 能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征[9], 是目前較為靈敏和特異的檢測技術(shù), 因而在細(xì)胞凋亡的研究中被廣泛采用。本實驗結(jié)果表明, 朱砂七總蒽醌組凋亡細(xì)胞百分率顯著高于對照組, 說明其在體外可誘導(dǎo)肝癌SMMCC-7721細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡受抑與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，如何有效地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡成為目前腫瘤治療的新方向。因此，朱砂七總蒽醌可望成為新的抗腫瘤藥物，但朱砂七總蒽醌是如何誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用，其凋亡作用受哪些基因調(diào)控等尚需進(jìn)一步深入探討。

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