C57BL/6J胚鼠聽皮層神經(jīng)干細胞分離培養(yǎng)的研究*

孟德靜 陳繼川 任紅苗

神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)是具有自我更新增殖能力的細胞，可以分化為神經(jīng)元、星形細胞、膠質(zhì)細胞。Villa等[1]研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細胞高表達端粒末端轉(zhuǎn)移酶，能保持穩(wěn)定的細胞周期長度、有絲分裂潛能、分化和神經(jīng)元形成能力，所以神經(jīng)干細胞成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病細胞治療的良好的種子細胞。目前神經(jīng)干細胞移植在治療腦中風、帕金森病、腦創(chuàng)傷[2～4]等疾病方面取得了一定的進展，成為研究熱點。本研究采用不同方法培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，為神經(jīng)干細胞的臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1實驗動物與試劑 孕14 d C57BL/6J小鼠購于第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所動物中心；Neurobasal培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)、青霉素-鏈霉素雙抗、堿性成纖維生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)、胰島素、B27均購于Gibco公司；多聚賴氨酸(Poly-L-lylin)、巢蛋白多克隆抗體(Nestin PcAb)、β微管蛋白(β-tubulin Ⅲ)單克隆抗體、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)多克隆抗體購于Sigma公司；CCK-8(cell counting kit-8)試劑盒購于碧云天生物技術研究所；免疫熒光二抗購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2實驗方法 將12只孕14 d C57BL/6J小鼠隨機分為酶消化組和機械吹打組，每組6只，將孕14 d的孕鼠頸椎脫臼處死，放入75%酒精中浸泡5 min，無菌條件下取出胚鼠，解剖顯微鏡下分離胚鼠聽皮層腦組織并剝離腦膜，分別用酶消化法(酶消化組)和機械吹打法(機械吹打組)進行原代培養(yǎng)。

1.2.1酶消化法胚鼠NSCs原代培養(yǎng) 將剝離腦膜后的胚鼠腦組織放入小瓶中，并用無菌剪刀將腦組織剪成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，瓶中加入5～10倍0.25%胰蛋白酶37 ℃孵箱中消化10 min。隨后5%胎牛血清終止消化，培養(yǎng)基洗兩遍后，剪刀進一步剪碎組織，加入培養(yǎng)基輕輕吹打直至培養(yǎng)基變渾濁見不到組織塊為止。用200目細胞篩過濾后移入離心管中800 r/min離心5 min，棄去上清，用無血清條件培養(yǎng)基(Neurobasal培養(yǎng)基、2% B27、EGF 20 ng/ml、bFGF 20 ng/ml、insulin 100 μg/ml)重懸細胞，細胞計數(shù)，以2×105個/ml的密度接種于直徑6 cm培養(yǎng)皿中，于37 ℃、5% CO2、95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天半量換液一次。

1.2.2機械吹打法胚鼠NSCs原代培養(yǎng) 將剝離腦膜后的聽皮層腦組織放入離心管中，用無菌剪刀將腦組織剪碎，然后加入培養(yǎng)基輕輕吹打直至變渾濁見不到組織塊為止。用200目細胞篩過濾后移入離心管中800 r/min離心5 min，用條件培養(yǎng)基(Neurobasal培養(yǎng)基、2% B27、EGF 20 ng/ml、bFGF 20 ng/ml、insulin 100 μg/ml)重懸細胞，并進行細胞計數(shù)，然后以2×105個/ml的細胞密度接種于直徑6 cm培養(yǎng)皿中，于37 ℃、5% CO2、95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液一次。

1.2.3小鼠NSCs巢蛋白免疫熒光鑒定 用傳到第三代的細胞行Nestin蛋白鑒定。將培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞離心重懸吸取少許滴在經(jīng)多聚賴氨酸包被的蓋玻片上，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h，待貼壁后PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，每次5 min；0.3% TritonX-100 30 min,PBS洗3次，每次5 min；正常山羊血清封閉30 min；棄去血清勿洗，滴加兔來源Nestin一抗(1:800),4 ℃孵育過夜，PBS洗3次，每次5 min；滴加TRITC標記的山羊抗兔IgG(1:100),37 ℃孵育1 h，PBS洗3次，每次5 min；DAPI( 4'-6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，4'，6-二脒基-苯基吲哚；Sigma公司)染核后甘油封片，激光共聚焦顯微鏡(LeicaTCS SP2，德國)觀察照相。同時做陰性對照試驗(只加二抗，不加一抗)。

1.2.4小鼠NSCs分化能力鑒定 培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞離心后，用Neurobasal培養(yǎng)基重懸，在放入多聚賴氨酸包被的蓋玻片的六孔板中培養(yǎng)并加入10%胎牛血清，誘導分化培養(yǎng)7天。取出蓋玻片PBS洗3次，每次5 min；4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，每次5 min；0.3% TritionX-100 30 min，PBS洗3次，每次5 min；正常山羊血清封閉37 ℃ 30 min；棄去血清，分別滴加兔來源GFAP一抗(1:400)和小鼠來源β-tubulin Ⅲ一抗(1:800)，4 ℃孵育過夜，PBS洗3次，每次5 min；滴加TRITC和FITC標記的山羊抗兔和山羊抗小鼠二抗(1:100)，37 ℃孵育1 h，PBS洗3次，每次5 min；DAPI(4'-6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，4'，6-二脒基-苯基吲哚；Sigma公司)染核后甘油封片，激光共聚焦顯微鏡(LeicaTCS SP2，德國)下觀察照相，同時做陰性對照(只加二抗，不加一抗)。

1.2.5CCK-8檢測兩種方法培養(yǎng)的NSCs細胞增殖 將酶消化法和機械吹打法培養(yǎng)的NSCs分別以2×105個/ml的密度接種于96孔板中，每孔100 μl，各設6個復孔。分別在0、24、48、72 h每孔加入10 μl的CCK-8工作液，37 ℃中避光孵育4 h后，檢測450 nm處的吸光度值(A450)。

2 結果

2.1酶消化法和機械吹打法分離的神經(jīng)干細胞的生長狀況 酶消化法分離下來的神經(jīng)干細胞單個分散存在，呈圓形，折光性強，并且雜質(zhì)比較少(圖1e)。機械吹打神經(jīng)干細胞雜質(zhì)比較多(圖1a)。酶消化法原代培養(yǎng)的單個神經(jīng)干細胞計數(shù)為(1.57±0.05)×105個/ml，機械吹打法分離的細胞計數(shù)為(1.07±0.04)×105個/ml，酶消化法分離下來的細胞比機械吹打法分離的神經(jīng)干細胞多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1)。

表1 酶消化法和機械吹打法分離的神經(jīng)干細胞原代培養(yǎng)計數(shù)(×105 個/ml，n=6)

注：*與機械吹打法比較，P<0.05

接種第二天，酶消化組神經(jīng)干細胞懸浮生長并克隆生長成球，形狀規(guī)則呈桑葚樣(圖1f)；機械吹打組沒有形成規(guī)則的神經(jīng)干細胞球，而是聚集成片(圖1b)，可能由于雜質(zhì)太多，影響神經(jīng)干細胞克隆成規(guī)則的神經(jīng)干細胞球。

接種第三天，酶消化組神經(jīng)干細胞球繼續(xù)克隆生長，體積增大，由于體積過大，營養(yǎng)不夠，干細胞球中央變暗壞死(圖1g)，要進行換液或是傳代處理。機械吹打組細胞仍然沒有形成規(guī)則的神經(jīng)干細胞球，成云片樣聚集生長(圖1c)。

酶消化組傳代后神經(jīng)干細胞仍然克隆成球，形態(tài)規(guī)則(圖1h)，具有自我更新和不斷增值的能力。機械吹打組傳代后神經(jīng)干細胞逐漸克隆形成規(guī)則的神經(jīng)干細胞球(圖1d)，說明機械吹打原代培養(yǎng)雜質(zhì)影響神經(jīng)干細胞的生長，而酶消化法原代培養(yǎng)雜質(zhì)很少。

2.2神經(jīng)干細胞巢蛋白(Nestin)鑒定 兩組細胞 免疫熒光顯示細胞球巢蛋白(Nestin)染色均為陽性(圖2)，說明兩組培養(yǎng)的細胞均為神經(jīng)干細胞，兩種培養(yǎng)方法均可行。

2.3神經(jīng)干細胞誘導分化能力鑒定 兩種方法培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞在有血清和無生長因子情況下均分化成神經(jīng)元，在7天后形成比較成熟的神經(jīng)元，神經(jīng)元突起較少、較長(圖3a～c)。神經(jīng)干細胞分化形成的星形膠質(zhì)細胞較多，突起較多，且粗大(圖3d～g)。

2.4兩種方法培養(yǎng)神經(jīng)干細胞的增殖情況 兩組細胞接種后生長良好，形成神經(jīng)干細胞球，在接種后24、48、72 h測得的A450值酶消化組大于機械吹打組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明酶消化法分離培養(yǎng)的細胞增殖快于機械吹打法分離的細胞，機械吹打組雜質(zhì)多影響細胞的增殖生長(表2)。

3 討論

神經(jīng)干細胞在無血清培養(yǎng)基和分裂原的情況下可以保持不斷增殖的能力，去除分裂原或是加入血

表2 兩種方法培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞不同時間點的

注：*與機械吹打法比較，P<0.05

清都可導致神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)和少突膠質(zhì)細胞[5]。堿性成纖維生長因子(bFGF)和表皮生長因子(EGF)是神經(jīng)干細胞增殖生長必不可少的生長因子[6]，除去堿性成纖維生長因子的細胞將在二十四小時內(nèi)分化。培養(yǎng)神經(jīng)干細胞時加入bFGF和EGF或是滅活的血清可以使巢蛋白表達陽性的細胞從44.1%上升到62.5%[7]。本研究采用無血清培養(yǎng)的方法并分別加入20 ng/ml的bFGF和EGF，神經(jīng)干細胞生長良好，增殖成神經(jīng)干細胞球，呈桑葚狀，折光性強；用加入胎牛血清的無生長因子培養(yǎng)基誘導其分化，一周后分化為成熟的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞。有研究顯示接種細胞的密度對細胞的生長也有影響，細胞密度過低會導致細胞生長緩慢，而密度過高對細胞的生長有抑制作用[8]，以密度2×(104～105)個/ml接種的細胞生長狀態(tài)良好[9]。故本實驗以2×105個/ml的密度接種，結果顯示細胞生長良好。

巢蛋白(Nestin)最初形成于胚鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，最早在胚鼠的神經(jīng)干細胞中發(fā)現(xiàn)[10]。隨著神經(jīng)干細胞的分化其表達量下降，最終表達終止。很多研究顯示神經(jīng)干細胞都表達Nestin，可用其作為神經(jīng)干細胞的標志，用于神經(jīng)干細胞的鑒定[11]。β微管蛋白在神經(jīng)元中表達，在非神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞中不表達，近來用于神經(jīng)元的鑒定。星形膠質(zhì)細胞胞體比較大，神經(jīng)干細胞可以分化為數(shù)量比較多的神經(jīng)膠質(zhì)細胞，很多研究者應用膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)作為星形膠質(zhì)細胞的特異性標志蛋白[12]。本研究用傳代培養(yǎng)后的第三代細胞進行熒光鑒定，顯示Nestin表達陽性，說明培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞比較純，兩種培養(yǎng)方法均可行，并且可以誘導分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞，培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞具有誘導多向分化能力。

神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)是目前很多疾病細胞治療研究的基礎，Lendahl等[10]成功地從孕13.5 d的胚鼠海馬腦組織中分離出神經(jīng)干細胞，為其后的研究奠定了基礎。Anna Erlandsson等[13]用孕15 d的小鼠腦組織機械研磨，沉淀10分鐘，然后離心后重懸細胞，進行神經(jīng)干細胞培養(yǎng)。本研究顯示機械研磨培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞含有的雜質(zhì)多，生長速度受到雜質(zhì)的影響，并且克隆增殖形成的神經(jīng)干細胞球不規(guī)則，要經(jīng)過多次傳代才能培養(yǎng)出生長快速并且形態(tài)

圖1原代和傳代后神經(jīng)干細胞(×100) a～c:機械吹打法培養(yǎng)細胞(培養(yǎng)即刻、1天、2天)；d：機械吹打法傳代細胞培養(yǎng)1天 ；e～g:酶消化法培養(yǎng)細胞(培養(yǎng)即刻、1天、2天)；h：酶消化法傳代細胞培養(yǎng)1天

圖2酶消化組神經(jīng)干細胞鑒定a：DAPI標記細胞核；b：神經(jīng)干細胞的Nestin抗體表達陽性(紅色) ；c：a與b的合成圖

圖3神經(jīng)干細胞分化能力鑒定a:DAPI標記細胞核；b:神經(jīng)元β-tubulin Ⅲ表達陽性(綠色)；c:a與b的合成圖；d:DAPI標記細胞核；e、f:星形膠質(zhì)細胞GFAP表達陽性(綠色、紅色)；g:d與e、f的合成圖

規(guī)則的神經(jīng)干細胞。而酶消化法獲得的神經(jīng)干細胞雜質(zhì)少，細胞生長快，且規(guī)則，所需的傳代次數(shù)少就可以獲得比較純的神經(jīng)干細胞，比機械吹打法更迅速，方法更簡捷。由于機械吹打原代培養(yǎng)很難把組織塊吹散，用力過大會影響細胞的活性，并且雜質(zhì)很難去除，只有經(jīng)過多次傳代才能克服這些缺點，比較費時。本研究利用CCK-8檢測兩種方法原代培養(yǎng)的細胞的增殖情況，結果顯示在培養(yǎng)后24、48、72 h酶消化組細胞增殖比機械吹打組快，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明機械吹打法培養(yǎng)的細胞雜質(zhì)較多，對細胞的增殖可產(chǎn)生不良的影響。

綜上所述，用酶消化法和機械吹打法均能分離培養(yǎng)出具有自我增殖和誘導多向分化能力的神經(jīng)干細胞，但與機械吹打法相比，酶消化法傳代次數(shù)少就可以獲得比較純的神經(jīng)干細胞，形成的神經(jīng)干細胞比較規(guī)則，省時便捷。

4 參考文獻

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