水楊酸鈉致耳鳴大鼠腦海馬區(qū)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子的表達＊

解為全 廖華 楊希林 陳抗松 鄒哲飛 李暐

耳鳴是指個體在外界無聲源或電刺激的情況下主觀感覺耳內(nèi)或者顱內(nèi)有聲音，是一種常見的臨床癥狀［1］。部分耳鳴患者通過轉(zhuǎn)移注意力能夠耐受耳鳴，部分耳鳴患者由于持續(xù)、枯燥耳鳴聲嚴(yán)重影響學(xué)習(xí)和生活，甚至出現(xiàn)焦慮、抑郁等情緒障礙。同時，焦慮、抑郁等情緒障礙可以加重患者對耳鳴的主觀感覺，從而形成惡性循環(huán)，給患者帶來極大痛苦［2］。耳鳴產(chǎn)生的機制尚不明確，目前被廣泛認可的理論由Jastreboff［3］提出，他認為耳鳴產(chǎn)生于聽覺皮層下中樞對神經(jīng)末梢的微弱信號的覺察處理過程中，與自主神經(jīng)系統(tǒng)和邊緣系統(tǒng)密切相關(guān)。因此，情緒相關(guān)腦區(qū)參與耳鳴的發(fā)生、發(fā)展、維持以及耳鳴發(fā)病的心理機制成為耳科學(xué)家及心理學(xué)家的研究熱點。促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（corticotropin－releasing facotr，CRF）作為急慢性應(yīng)激應(yīng)答的驅(qū)動因子廣泛存在于情緒相關(guān)腦區(qū)，與應(yīng)激、情緒、學(xué)習(xí)和記憶等行為活動密切相關(guān)，可能在耳鳴引起負性情緒和大腦海馬區(qū)對耳鳴的病理性記憶中起重要作用。本研究擬通過檢測水楊酸鈉致耳鳴大鼠模型海馬區(qū)CRF的表達，探討CRF與耳鳴的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康Wistar大鼠30只（購自武漢大學(xué)A3動物實驗室），體重200～300g，2～3月齡，耳廓反應(yīng)靈敏，雌雄不拘，無強噪聲暴露及耳毒性藥物使用史。隨機分為A、B、C 三組，每組10只，A 組每天注射10%水楊酸鈉溶液（購自Sigma公司）350 mg／kg，共注射21 天；B 組每天注射10%水楊酸鈉溶液350 mg／kg，共注射14 天；C 組為陰性對照組，每天同時間注射等量生理鹽水14天。

1.2 動物耳鳴行為學(xué)檢測 大鼠耳鳴行為學(xué)檢測最經(jīng)典的方法是Jastreboff提出的飲水抑制法［4］，本實驗參考Jastreboff經(jīng)典飲水抑制法并在此基礎(chǔ)上將足部電擊改為嘴部電擊。在水楊酸鈉注射前采用飲水抑制法對三組大鼠進行條件反射訓(xùn)練，使大鼠形成“聲音出現(xiàn)－飲水開始，聲音消失－飲水停止”的條件反射，條件反射建立后停止訓(xùn)練并開始注射水楊酸鈉，條件反射消退期1～3天測量飲水抑制率（R），R＝B／（A＋B），其中B 為條件刺激（背景噪聲停止）期1min內(nèi)大鼠的飲水次數(shù)，A 為條件刺激之后1min內(nèi)大鼠飲水次數(shù)。

1.3 ABR 檢測 分別于給藥前、首次給藥后2h、給藥結(jié)束當(dāng)天對各組大鼠行ABR 檢測。檢測均在環(huán)境噪聲＜30dB SPL 的隔聲屏蔽室中進行，動物腹腔注射1%戊巴比妥鈉50 mg／kg麻醉，記錄電極置于顱頂正中位置，參考電極置于同側(cè)耳后皮下，鼻尖接地。探測音由SigGenRP2（TDT）軟件包編譯，TDT（Tucker－Davis Technology）系統(tǒng)校準(zhǔn)后連接高頻電磁揚聲器（MF1）給聲，采用BioSigRP2（TDT）軟件包記錄分析結(jié)果。采用短聲（click）刺激，極間電阻＜5kΩ，刺激率為21次／秒，觀察時程10ms，濾波帶寬100～3 000 Hz，疊加500次，以引出波Ⅲ的最小刺激強度為反應(yīng)閾。

1.4 Western blot檢測大鼠腦海馬區(qū)CRF表達 給藥結(jié)束當(dāng)天各組動物處死后斷頭取腦，根據(jù)George Paxinos ＆Charles Watson大鼠立體定位圖譜［5］定位大鼠腦海馬區(qū)，體式顯微鏡下掀開大腦皮層后迅速完整剝離海馬，整個取材過程冰上操作，取材后將組織置于－80 ℃冰箱保存。各組標(biāo)本分別稱重，加入適量RIPA 裂解液后冰上勻漿，4 ℃12 000rpm 離心，取上清液，BCA 法測蛋白濃度，各樣品取50μg總蛋白上樣，恒壓120V／40mA，12%的SDS－PAGE凝膠電泳。根據(jù)預(yù)染溴酚藍顯示，目的蛋白充分分離后，停止電泳。取出凝膠，切下目的條帶，蒸餾水沖洗后200 mA 恒流PVDF 膜轉(zhuǎn)膜，用含5% 含脫脂奶粉的TBST 封閉液室溫封閉2 h，將PVDF 膜浸泡于含兔抗鼠GAPDH 及兔抗鼠CRF一抗孵育液（1：500，Santa）中，4 ℃孵育過夜。TBST 緩沖液洗膜5min×5次，加入HRP 標(biāo)記二抗（1：40 000，武漢博士德生物公司），室溫搖床孵育2h。TBST 洗膜5min×5次，ECL 發(fā)光劑曝光、顯影，Gel Pro4.0 軟件進行灰度掃描分析，檢測條帶光密度比值（CRF／GAPDH），比較各組CRF 蛋白表達。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，各組數(shù)據(jù)總體差異采用單因素方差分析（One－way analysis of variance，One－Way ANOVA），組間多重比較采用LSD－t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)檢測結(jié)果 經(jīng)過5天的適應(yīng)性訓(xùn)練三組大鼠飲水抑制率均小于0.2，且R 值趨于穩(wěn)定，大鼠條件反射已經(jīng)建立。條件反射消退期1～3天A、B 兩組大鼠R 值大于C 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明耳鳴大鼠模型造模成功。從第4天開始，三組大鼠R 值差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 ABR 檢測結(jié)果 給藥前各組大鼠ABR 反應(yīng)閾差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。A、B兩組大鼠水楊酸鈉注射后2hABR 波形分化較差，反應(yīng)閾較注藥前和對照組明顯升高（P＜0.01）；對照組大鼠ABR 反應(yīng)閾與注射前差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。給藥結(jié)束后當(dāng)天，A、B 兩組大鼠ABR 反應(yīng)閾較首次給藥后2小時升高（P＜0.05），較對照組也明顯提高（P＜0.01），但A、B 兩組間ABR 反應(yīng)閾差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

表1 各組大鼠不同時間ABR 反應(yīng)閾比較（dB SPL，±s）（n＝20耳）

表1 各組大鼠不同時間ABR 反應(yīng)閾比較（dB SPL，±s）（n＝20耳）

注：＊與同組給藥前及對照組同一時間比較，P＜0.01；△與同組給藥后2h比較，P＜0.05

組別給藥前首次給藥后2h 給藥結(jié)束后A 組30.0±2.8 57.8±3.4＊61.7±3.6△＊B組30.2±2.2 58.9±4.4＊60.2±3.1△＊C組30.9±2.6 29.5±2.5 30.2±2.0

2.3 各組大鼠海馬區(qū)CRF 表達 給藥結(jié)束后A、B、C三組CRF／GAPDH 的值分別為0.25、0.23和0.09，可見A 組大鼠海馬區(qū)CRF表達最高，B 組次之，C 組表達最低，A、B 兩組與C 組大鼠海馬區(qū)CRF表達差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖1）。

圖1 Western blot法檢測三組大鼠腦海馬區(qū)CRF表達

3 討論

海馬不僅是邊緣系統(tǒng)的重要結(jié)構(gòu)，也是下丘腦－垂體－腎上腺（HPA）軸的高級調(diào)節(jié)中樞之一，在應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控中起到重要作用，與學(xué)習(xí)記憶、情緒調(diào)節(jié)等行為活動密切相關(guān)［6］。CRF 是由41個氨基酸組成的多肽，由下丘腦室旁核（PVN）分泌，能夠刺激垂體前葉皮質(zhì)釋放大量促腎上腺皮質(zhì)激素，被認為是應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)的驅(qū)動因子［7］。研究表明CRF 不僅存在于PVN，而且廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)其它區(qū)域如新皮質(zhì)、腦干和邊緣系統(tǒng)（杏仁核、海馬）。在海馬，CRF 能夠增強海馬椎體細胞興奮性，促進長時程增強（LTP）的誘導(dǎo)和形成，影響神經(jīng)突觸的結(jié)構(gòu)和數(shù)目，在學(xué)習(xí)記憶、情緒反應(yīng)以及神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中發(fā)揮著重要作用［8］。急性應(yīng)激和慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）動物模型可導(dǎo)致海馬對下丘腦抑制減弱，迅速合成的CRF激活HPA 軸調(diào)節(jié)機體應(yīng)激反應(yīng)。長時間的過度刺激可以持續(xù)興奮HPA 軸，促進海馬區(qū)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，使突觸后膜NMDA 受體增敏，形成病理性LTP，參與病理性及創(chuàng)傷性記憶的形成和鞏固［9］。同時，如果海馬受到高水平糖皮質(zhì)激素及興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的損傷，可導(dǎo)致神經(jīng)信息傳遞損害，引起學(xué)習(xí)、記憶、情緒障礙。

海馬和杏仁核是邊緣系統(tǒng)兩個主要的腦區(qū)，Mirz等［10］發(fā)現(xiàn)耳鳴患者的杏仁核及海馬的腦血流明顯增加，活性增強，提示邊緣系統(tǒng)參與了耳鳴的發(fā)病機理；O’Mara等［11］發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)穆曇舸碳た梢源龠M聽覺中樞系統(tǒng)和邊緣系統(tǒng)的神經(jīng)發(fā)育；海馬和杏仁核接受來自聽覺中樞的神經(jīng)纖維投射，同時海馬和杏仁核也直接或者間接投射纖維到聽皮層已經(jīng)得到證實［12］。本研究發(fā)現(xiàn)水楊酸鈉注射14天后大鼠海馬區(qū)CRF明顯上升，說明長期的耳鳴刺激可以持續(xù)興奮大鼠情緒相關(guān)腦區(qū)，并對大鼠海馬病理性記憶產(chǎn)生了影響；水楊酸鈉注射21天后CRF 表達繼續(xù)升高，一方面可能是使病理性記憶得到鞏固，另一方面可能通過多種機制損傷了海馬神經(jīng)元，參與了抑郁、焦慮情緒的發(fā)生。另外在耳蝸發(fā)現(xiàn)了局部類似HPA 軸的控制系統(tǒng)，CRF1基因敲除大鼠產(chǎn)生聽力損失，其具體機制尚不清楚，說明CRF 在聽覺形成中起到重要作用［13］，因此CRF 表達升高，可能在邊緣系統(tǒng)與聽覺中樞系統(tǒng)的復(fù)雜神經(jīng)纖維投射中起到橋梁作用。

水楊酸鈉致耳鳴動物模型是最常用的耳鳴動物模型，其外周及聽覺中樞機制已得到廣泛的研究［14］。經(jīng)典的飲水抑制法和近年來興起的驚跳反射前抑制（prepules inhibition of acoustic startle response，PPI）［15］等動物行為學(xué)模型均證實了350 mg／kg水楊酸鈉鈉溶液連續(xù)注射可以使動物產(chǎn)生持續(xù)2～3天的耳鳴。本實驗將經(jīng)典的飲水抑制法進行改進，同樣發(fā)現(xiàn)大鼠條件反射消退期1～3 天A、B兩組與C組大鼠飲水抑制率（R 值）存在差異，證實了水楊酸鈉可以使大鼠產(chǎn)生耳鳴，成功建立了水楊酸鈉致耳鳴大鼠模型。從文中結(jié)果看，水楊酸鈉注射2h后A、B兩組大鼠ABR 反應(yīng)閾發(fā)生了約30dB的閾移，與文獻報道一致［16］，水楊酸鈉注射14天組與21天組大鼠ABR 反應(yīng)閾變化不大，可能是水楊酸鈉對聽覺系統(tǒng)的作用達到飽和，也可能是大鼠對耳鳴的一種適應(yīng)。

總之，CRF 作為情緒應(yīng)激相關(guān)蛋白，可能與邊緣系統(tǒng)參與水楊酸鈉致耳鳴的發(fā)生、發(fā)展和維持的機制相關(guān)，在耳鳴的精神心理機制中起到了重要作用，說明長期慢性耳鳴刺激可能通過精神心理因素加重耳鳴病情。

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