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      鈣離子阻滯劑異搏定對擠壓傷大鼠保護作用的實驗研究

      2013-01-09 08:05:16楊昌宇劉開俊
      創(chuàng)傷外科雜志 2013年4期
      關鍵詞:阻滯劑自由基離子

      楊昌宇,劉開俊

      擠壓傷(crush injury)是一種常見的創(chuàng)傷,多見于自然災害、交通事故和戰(zhàn)傷,病死率極高。擠壓傷死亡原因在急性期主要是低血容量休克和高血鉀癥[1]。在后期,急性腎功能衰竭、多器官功能衰竭綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)和膿毒癥為最重要致死因素[2]。研究表明,骨骼肌受到長時間擠壓時,損傷貫穿于整個缺血期和再灌注期。而缺血期和再灌注期損傷都與大量Ca2+內(nèi)流,導致細胞內(nèi)外Ca2+濃度改變,形成細胞內(nèi)Ca2+超載有關[3]。

      目前關于擠壓傷研究大都是針對受損器官的保護。本實驗旨在建立擠壓傷動物模型的基礎上,采用鈣離子阻滯劑鹽酸維拉帕米注射液(異搏定),通過抑制細胞內(nèi)鈣超載的發(fā)生,探討鈣離子阻滯劑對擠壓傷的保護作用。本研究目的不是探討對受損傷器官的作用,而是主要針對減少代謝毒性物質(zhì)氧自由基和減少代謝毒性物質(zhì)進入血液循環(huán)對全身損害作用。

      材料與方法

      1 材料

      1.1 主要試劑和藥物 丙二醛測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)、冰醋酸(廣州新港化工廠)、異博定(上海禾豐制藥有限公司)、戊巴比妥鈉(武漢合中醫(yī)藥化工有限公司)。

      1.2 實驗動物 SD雄性大鼠40只,體重190~250g(購至同濟醫(yī)學院實驗動物中心)。

      1.3 主要儀器 PE聚乙烯導管(美國健康醫(yī)療儀器國際公司)、紫外可見分光光度計uv-3600(日本島津)、全自動生化分析儀(日本島津)、恒溫水浴箱(武漢科學儀器廠)、低速離心機LD4-2型(北京醫(yī)用離心機廠)、微量式移液器(北京明力普瑞科技有限公司)、漩渦混合儀(步海瀘西分析儀器廠)、加熱攪拌器(深圳Bio-Tek科學儀器廠)、普通光學顯微鏡(日本OLYMPUSTOKYO)、醫(yī)用凈化超凈工作臺(蘇州凈化設備公司)。

      2 實驗方法

      2.1 鼠頸外靜脈持久性置管 用1%戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射麻醉大鼠后,常規(guī)無菌操作。于頸中線偏左側(cè),切開皮膚,解剖并游離左頸外靜脈,結(jié)扎頸外靜脈遠端,將導管插入頸外靜脈,深約2.5~3.0cm,用絲線結(jié)扎固定。將頸部導管引至項部皮膚下露出體外并固定,用于給藥和取血。

      2.2 大鼠擠壓傷模型的建立 采用Akimau的方法,將大鼠俯臥于1塊12cm×9cm×1cm木板上,重量約3.0kg。大鼠四肢分別固定與木板四角鐵制的固定桿上。用2塊帶槽的木塊固定兩側(cè)大腿,保護股骨不致被壓斷,3.5kg鉛塊由上至下均勻擠壓,持續(xù)擠壓 6h[4]。

      2.3 實驗分組 40只大鼠隨機分為4組,分別為:(1)對照組(A):不擠壓動物并注射生理鹽水1ml/kg/h;(2)一般治療組(B):在擠壓時至解壓后3h僅注射生理鹽水1ml/(kg·h);(3)早期鈣離子阻滯劑(calcium channel blocker,CCB)異博定治療組(C):擠壓后當即輸注異搏定2mg/kg及輸注生理鹽水1ml/(kg·h)至解壓后3h;(4)解壓后CCB異搏定治療組(D):擠壓時和解壓后注射生理鹽水1ml/(kg·h),并在解壓后5min內(nèi)開始輸注異搏定2mg/kg治療。

      2.4 血清肌酸激酶(CK)的測定 分別在解壓前5min、解壓后3h通過頸外靜脈導管抽血各取全血標本1.0ml,3000r/min離心15min,生化自動分析儀檢測血清CK含量。

      2.5 血清丙二醛(MDA)的測定 血清MDA水平檢測采用硫代巴比妥法 。血清標本抽取方法同上。MDA含量測定按試劑盒操作表制備空白管、標準管和各測定管;旋渦混勻器混勻,試管口用聚乙烯薄膜扎緊,用針頭刺1個小孔;95℃水浴,40min;取出后流水冷卻,3500r/min,離心10min;取上清液,532nm處,1cm光徑,蒸餾水調(diào)零,測各管吸光度值(A532nm)。

      血清MDA計算公式:血清中MDA含量(nmol/ml)=(測定管吸光度-測定空白管吸光度/標準管吸光-標準空白管吸光度)×標準品濃度(10nmol/ml)×樣本測試前稀釋倍數(shù)。

      2.6 血清超氧化物歧化酶(SOD)的測定 血清SOD水平檢測采用黃嘌呤氧化酶法 。血清標本抽取方法同上,3000r/min離心15min。按試劑盒要求配制各試劑,用旋渦混勻器充分混勻,置37℃恒溫水浴40min。加入顯色劑。混勻,10min后倒入1cm光徑比色杯中,蒸餾水調(diào)零,波長550nm處比色。

      血清SOD活力計算公式:SOD活力(U/ml)=(對照管吸光度-測定管吸光度)/50% ×反應體系的稀釋倍數(shù)×樣本測試前的稀釋倍數(shù)。

      2.7 擠壓傷后大鼠活率測定 4組大鼠解壓3h后拔頸靜脈導管,結(jié)扎插管的頸靜脈,縫合頸部創(chuàng)口后釋放,重新放回籠中提供正常的飲食。從解壓后開始共計觀察72h,并分別在 12、18、24、36、72h 各時間段記錄大鼠死亡只數(shù),以觀察擠壓后72h各組存活率。

      3 統(tǒng)計學分析

      結(jié) 果

      1 擠壓傷各組血清CK水平的變化

      各擠壓傷組CK水平明顯增高。但早期使用CCB治療組血清CK水平在各擠壓傷組最低。在解壓后3h,單純擠壓傷組血清CK水平最高,與對照組及CCB治療各組間具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見表1。

      表1 擠壓傷后大鼠血清CK水平的變化(±s,u/L)

      表1 擠壓傷后大鼠血清CK水平的變化(±s,u/L)

      與對照組比較:▲P<0.01;與一般治療組比較:●P<0.01

      組別 例數(shù) 解壓前5min 解壓后3h A組 10 2066.89±198.64 2065.91±198.64●B組 10 6340.23±299.67▲ 9212.50±567.87 C組 10 4176.72±376.49▲● 6857.58±409.68●D組 10 6340.85±299.69▲ 8318.75±545.98●

      2 擠壓傷各組MDA血清水平的變化

      擠壓前5min,擠壓傷各組大鼠血清MDA含量升高,與對照組比較差異有顯著意義。在擠壓傷各組血漿中,早期使用CCB治療組含量最低。與其他擠壓傷組比較具有統(tǒng)計學意義。解壓后3h,在擠壓傷各組大鼠血漿中,一般治療組MDA含量升高最為明顯,解壓后運用CCB治療組含量次之,早期使用CCB治療組含量最低。一般治療組MDA含量與其他組間具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見表2。

      表2 擠壓傷后大鼠血清MDA水平的變化(±s,nmol/L)

      表2 擠壓傷后大鼠血清MDA水平的變化(±s,nmol/L)

      與對照組比較:▲P<0.01;與一般治療組比較:●P<0.01

      組別 例數(shù) 解壓前5min 解壓后3h A組 10 4.14 ±0.33 4.14±0.33●B組 10 7.34±0.24▲ 8.89±0.15 C組 10 5.40±0.46▲● 6.20±0.37●D組 10 7.65±0.55▲ 8.01±0.38●

      3 擠壓傷各組血清SOD水平的變化

      擠壓各組血清SOD在解壓前5min含量與對照組比較明顯升高,具有顯著差異。其中早期使用CCB治療組含量最低,與其他擠壓傷組含量具有統(tǒng)計學意義。解壓后3h,血漿SOD水平均降低,其中一般治療組血清SOD含量最低,早期使用CCB治療組含量最高,一般治療組血清SOD含量與各組間具有統(tǒng)計學意義,見表3。

      表3 擠壓傷后大鼠血清SOD水平的變化(±s,u/L)

      表3 擠壓傷后大鼠血清SOD水平的變化(±s,u/L)

      與對照組比較:▲P<0.01;與一般治療組比較:●P<0.01

      組別 例數(shù) 解壓前5min 解壓后3h A組 10 2066.95±199.84 2066.95±198.84●B組 10 6339.15±298.74▲ 9212.51±569.87 C組 10 4177.12±378.41▲● 6858.43±409.73●D組 10 6342.14±299.74▲ 8319.05±545.88●

      4 擠壓傷后大鼠存活率

      在擠壓傷各組大鼠中,死亡大多數(shù)發(fā)生在24h內(nèi),約占死亡總數(shù)的81%,死亡原因可能與高血鉀和低血容量休克有關。一般治療組10只大鼠24h內(nèi)死亡7只(死亡率為70%),72h內(nèi)死亡8只(死亡率為80%);擠壓后CCB治療組24h內(nèi)死亡5只(死亡率為50%),72h死亡8只(死亡率為80%);早期運用鈣離子阻滯劑組72h死亡例數(shù)僅為2例(死亡率為20%),見表4。4組總體之間有顯著性統(tǒng)計學差異(P=0.0012<0.01)。早期運用鈣離子阻滯劑組死亡例數(shù)與一般治療組比較,有顯著差異(P=0.01),見圖1。

      表4 各組擠壓傷大鼠72h各時間段死亡例數(shù)

      圖1 各治療組大鼠生存曲線的比較

      討 論

      骨骼肌能耐受輕微的缺血2h,2~4h的缺血可導致不可逆的解剖功能的改變。在缺血期由于肌肉受到機械擠壓,導致肌細胞膜牽張感受器,激活離子通道開放,促使Ca2+內(nèi)流。組織灌溉不足和細胞缺氧使細胞無氧代謝增多,三磷酸腺苷(ATP)生成減少,Na+/K+-ATP泵活性降低,造成細胞內(nèi)Na+排出減少,濃度增高。再灌注后細胞為了恢復正常的生理功能,一方面激活Na+/K+-ATP泵,另一方面快速激活Na+/Ca2+交換蛋白,以加快Na+細胞外流,以維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,同時也將大量Ca2+運入細胞內(nèi)。血液再灌注時細胞為了排出過多的H+,也通過Na+/H+交換,使胞外Na+內(nèi)流,而再次通過Na+/Ca2+交換,促進Ca2+內(nèi)流。缺血再灌注期也可通過第二信使途徑增加Na+/Ca2+交換,使胞漿Ca2+濃度升高。另一方面,在再灌注時細胞產(chǎn)生的大量的自由基,破壞細胞膜結(jié)構(gòu),也可促進鈣超載的發(fā)生。

      肌肉壞死一般發(fā)生在缺血6h[5-6]。肢體較長時間受到擠壓時,受壓部位肌肉內(nèi)的血液供氧發(fā)生障礙,甚至阻斷。組織細胞發(fā)生缺血缺氧后,功能下降,甚至壞死,并釋放毒性壞死產(chǎn)物。當解壓后,組織細胞重新獲得血液氧氣供給,損傷應隨即停止,但相應的組織細胞功能,代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞更為嚴重,即出現(xiàn)了缺血再灌注損傷[7]。而缺血再灌注損傷在造成擠壓局部組織細胞損傷的同時,更嚴重的是起其他遠隔部位臟器的損害[8]。其主要機制是受擠壓局部組織細胞的有害物質(zhì)隨血液循環(huán),影響及損害其他器官組織,嚴重可造成多個臟器功能衰竭。

      研究表明,骨骼肌細胞Ca2+的改變是缺血期和再灌注期擠壓組織損傷的主要原因之一。其機制為在缺血期Ca2+在細胞內(nèi)大量聚集,從而激活中心蛋白水解酶、Ca2+依賴磷酸激酶、核酸蛋白酶及脂質(zhì)過氧化反應使受壓骨骼肌細胞變性、壞死、橫紋肌溶解。另一方面,當肌肉組織受到擠壓發(fā)生缺血缺氧時,產(chǎn)生大量一氧化氮和氧自由基。這些自由基可通過直接攻擊生物大分子,膜通道后增加炎癥細胞的黏附和游出,脂質(zhì)過氧化作用等方式造成細胞結(jié)構(gòu)損傷和功能代謝障礙[9]。作為自由基脂質(zhì)過氧化的醛或終產(chǎn)物之一MDA,毒性作用最大,可使酶等帶有氨基的大分子化合物發(fā)生交聯(lián),加重了有活性的蛋白質(zhì)變性;同時也破壞體內(nèi)的核酸和染色體[9]。它的含量反應機體脂質(zhì)過氧化的程度,可間接反應組織受自由基損傷的程度。SOD是一種重要的氧自由基清除劑,他對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用,此酶能清除歧化超氧陰離子,其活性高低可反應體內(nèi)抗自由基水平、SOD和MDA可間接反應自由基代謝水平。肌酸激酶在肌細胞中含量豐富,當肌細胞損傷時,其大量進入血,其在血清中的水平與肌肉的損傷程度相關聯(lián),也是反映肌肉損傷的重要指標之一。本實驗通過血清CK、MDA、SOD水平作為反映大鼠受擠壓損傷程度和抗氧自由基指標。CCB是一組能夠阻止各種病理因素導致Ca2+細胞內(nèi)流的藥物,在心血管疾病治療中廣泛應用。而近年來發(fā)現(xiàn)CCB可選擇阻斷在缺血缺氧等病理狀態(tài)下的鈣超載,而不影響正常的細胞鈣平衡[10]。研究表明鈣離子阻滯劑異搏定能減輕大鼠在組織缺血再灌注損傷過程中脂質(zhì)過氧化,抑制鈣離子內(nèi)流,降低組織細胞的破壞程度[11]。

      本研究表明對照組血清CK、MDA明顯低于其他擠壓傷組血清,具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。說明由于物理擠壓和缺血再灌注損傷促使肌細胞大量破壞,導致細胞內(nèi)物質(zhì)CK和代謝產(chǎn)物MDA大量入血而異常增高。通過在解壓前和解壓后應用CCB治療組血清MDA、CK水平低于一般治療組(P<0.01),其中解壓前5minCCB治療組血清CK、MDA明顯低于其他兩擠壓傷組(P<0.01),提示CCB不但能夠減輕機械擠壓對下肢的損傷,而且對解壓后缺血再灌注氧自由基對機體的損傷亦有保護作用(如表1、2)。

      而作為氧自由基清除劑SOD在細胞損傷時也大量入血,因此在解壓前5min各擠壓傷組明顯高于對照組,具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。其中早期CCB治療組SOD水平明顯低于其他兩擠壓傷組(P<0.01)。但解除擠壓后隨著氧自由基的大量消耗,血清 SOD水平 逐漸下降,其中解壓后3h各CCB治療組SOD水平明顯低于一般治療組(P<0.01),說明CCB能夠通過減少氧自由基的產(chǎn)生和降低SOD的消耗,從而降低氧自由基對機體的損傷,使血清SOD水平可維持較高水平(如表3)。通過生存分析比較亦發(fā)現(xiàn)早期使用鈣離子阻滯劑干預組的大鼠,其72h存活率明顯高于單純擠壓傷組(P<0.01),其原因可能為減少血液循環(huán)中氧自由基等有害物質(zhì)對全身損傷。

      本實驗通過各大鼠擠壓傷組分別對肌肉損傷的重要指標肌酸激酶,反映組織受自由基損傷程度的脂質(zhì)過氧化物的終產(chǎn)物之一MDA,抗自由基水平氧自由基清除劑SOD血清水平及72h存活率比較,發(fā)現(xiàn)CCB治療組各項結(jié)果明顯優(yōu)于單純治療組。提示鈣離子阻滯劑能夠減輕擠壓傷對機體的損傷。其可能機制為鈣離子阻滯劑通過阻斷損傷肌細胞Ca2+內(nèi)流病理過程,一方面減輕局部骨骼肌的損傷,另一方面減少代謝毒性物質(zhì)和氧自由基進入血液循環(huán)對全身的損害。而生存分析比較提示早期CCB治療組存活優(yōu)于解壓后治療組,說明CCB對擠壓傷的治療應及早進行。

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