ABRA在不同年齡大鼠腰段脊髓中的表達變化

劉麗華 伍校瓊 楊寶林 關(guān)瑩露 簡曉紅 朱 武 蔡維君＊？剼？

（1中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)系，長沙410013；2中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)系，長沙410013；3湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院護理系，長沙410013）

ABRA（Actin binding Rho activator）也稱為STARS（striated muscle activator of Rho signaling）與MS1（Myocyte Stress－1），是近年 Arai等人首先在心臟發(fā)現(xiàn)的一種結(jié)合在肌小節(jié)I帶的43 kD的肌動蛋白結(jié)合蛋白（actin－binding proteins，ABPs），能激活Rho信號，使肌動蛋白單體（G－actin）與肌動蛋白絲（F－actin）結(jié)合增加，從而增強肌動蛋白的多聚化，并對多聚化形式的actin有穩(wěn)定作用［1－4］。其C末端含有兩個獨立的F－actin結(jié)合區(qū)域 （ABD1／ABD2），具有肌動蛋白結(jié)合功能［5］。Kuwahara等研究發(fā)現(xiàn)ABRA參與了心肌肥大與心肌病的病理過程［6］，Lamon等發(fā)現(xiàn)在阻力訓(xùn)練引起的骨骼肌肥大中，ABRA表達上調(diào)［7］，Troidl等發(fā)現(xiàn)提高側(cè)支血管ABRA的表達能明顯地促進側(cè)支血管的快速生長［4，8］。這些研究表明ABRA參與調(diào)節(jié)actin的功能，增強actin的多聚化，從而對心肌、骨骼肌、平滑肌細(xì)胞的功能具有重要的作用。最近，我們課題組發(fā)現(xiàn)ABRA在神經(jīng)系統(tǒng)中也有表達，提示ABRA在神經(jīng)系統(tǒng)亦具有一定的作用［9］。脊髓神經(jīng)元的分化演變，生長發(fā)育過程受各種理化因子或相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)與控制，如角蛋白、神經(jīng)細(xì)絲蛋白等［10］。作為ABPs新加入的成員之一，ABRA是否對脊髓的生長發(fā)育具有一定作用呢？此前，ABRA在不同年齡大鼠脊髓中表達未見相關(guān)報道。為此，本研究運用Western blot及免疫熒光術(shù)檢測ABRA在不同年齡階段大鼠腰段脊髓的表達變化，為進一步研究其在脊髓中的功能活動提供形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。

材料和方法

1.材料

不同年齡階段正常SD大鼠（中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供）共計36只，雄雌不限，新生鼠（生后7d）、成年鼠（6m）、老年鼠（20m）各 12只。其中不同年齡階段的各6只用于蛋白質(zhì)提取，其余用于免疫組織化學(xué)檢測。所有動物的實驗處理過程，均按中南大學(xué)實驗動物操作規(guī)則進行。

2.方法

2.1 Western blot檢測

不同年齡階段大鼠腹腔麻醉后，在冰上將各組腰段脊髓（L4－L6）迅速取出，稱重后，以100 mg／ml加入組織裂解液（1∶100加入蛋白酶抑制劑），冰浴勻漿。以1℃，12000轉(zhuǎn)／分鐘離心20min左右，吸取上清，以BCA法進行蛋白定量，沸水中煮沸變性，冷卻后置4℃保存。分別取不同年齡階段腰段脊髓組織蛋白樣品各40μg，行SDS－PAGE（分離膠濃度為10%）電泳，后進行濕式電轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移后的NC膜（Millipore公司）用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉90min，兔ABRA多克隆抗體 （1∶200，sigma，美國）和鼠GAPDH抗體室溫孵育1 h后，4℃過夜，然后轉(zhuǎn)入 HRP－羊抗兔IgG（1∶2000）和HRP－驢抗鼠IgG（1∶1000）中，室溫孵育2h，每次抗體孵育后均用TBST漂洗10min×3次，ECL發(fā)光，顯影，定影。免疫印跡照片用激光掃描儀掃描成圖片后用Image－pro plus（IPP）6.0軟件分別測定各蛋白條帶的光密度（OD）值，以ABRA條帶的OD值與相應(yīng)內(nèi)參GAPDH條帶的OD值比值表示ABRA蛋白相對量。

2.2 灌注取材和切片準(zhǔn)備

將實驗用大鼠，以10%水合氯醛溶液經(jīng)腹腔注射（4mg／kg）麻醉成功后，剪開胸腔，顯露心臟，從左心室插管至主動脈，剪開右心耳?？焖俟嘧⑸睇}水，待流出的液體清亮后，再灌注4%多聚甲醛固定。取腰段（L4－L6）脊髓放入4%多聚甲醛溶液中后固定，常規(guī)梯度浸糖至組織塊沉底后取出，OCT復(fù)合物包埋，用三頓冷凍切片機連續(xù)切片，片厚15μm。

2.3 免疫熒光組織化學(xué)顯色

組織切片用5%BSA封閉1h后同時加入一抗兔來源ABRA多克隆抗體 （1：50，sigma，美國）與小鼠來源 Neu N單克隆抗體（1：2000，sigma，美國），4℃過夜，然后加入生物素化羊抗兔IgG（1：200，sigma，美國）及偶聯(lián)熒光素Cy3的驢抗鼠IgG（1：200，sigma，美國），室溫孵育2 h，再加入鏈霉親和素偶聯(lián)的熒光素 Cy2（1：500），室溫孵育lh，其中除5%BSA封閉之外，其余每次抗體孵育后均用0.01mol／L PBS洗3次，每次10min。

陰性對照用PBS代替一抗，其余各步驟均同，以排除二抗的非特異性染色。

Nikon熒光顯微鏡觀察并拍照，圖片用EZ－C1 3.70 FreeViewer進行處理。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1.ABRA在不同年齡階段腰段脊髓中的蛋白水平表達變化

Western blot結(jié)果顯示，與成年組、老年組比較，新生組大鼠腰段脊髓中的蛋白表達水平最高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），成年組與老年組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，有代表性的印跡條帶及至少三次重復(fù)實驗光密度掃描后統(tǒng)計結(jié)果 （見圖1）。

2.ABRA在不同年齡階段腰段脊髓中的細(xì)胞定位

在腰髓前角，ABRA廣泛表達于神經(jīng)元的胞核、胞漿和突起，與前角運動神經(jīng)元存在共定位（圖2、圖6）。陽性細(xì)胞計數(shù)顯示：與成年組（0.33±0.05）、老年組（0.36±0.02）比較，新生鼠（0.18±0.03）ABRA＋Neu N雙陽性細(xì)胞占總ABRA陽性細(xì)胞百分比最低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），成年組與老年組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖3）。

在腰髓后角，ABRA與小的Neu N（神經(jīng)元標(biāo)記物）陽性感覺神經(jīng)元存在共定位，也主要表達在神經(jīng)元胞核、胞漿和突起內(nèi)（圖4）。陽性細(xì)胞計數(shù)顯示：與成年組（0.67±0.06）、老年組（0.71±0.05）比較，新生鼠（0.40±0.04）ABRA＋Neu N雙陽性細(xì)胞占總ABRA陽性細(xì)胞百分比最低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），成年組與老年組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖5）。

討 論

ABRA是2002年Arai等使用差異基因篩選獨自鑒定的表達在小鼠胚胎心臟的新基因［1］以及Mahadeva等利用分子索引鑒別的在左心室負(fù)荷過大下的調(diào)節(jié)基因［2］，隨后的研究發(fā)現(xiàn)ABRA還參與了心肌肥大、骨骼肌肥大的病理過程及側(cè)支血管生長，ABRA通過參與調(diào)節(jié)actin的功能，增強actin的多聚化，對心肌、骨骼肌、平滑肌細(xì)胞的功能起重要的作用［4，6－8］。

我們課題組前期研究顯示ABRA在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達，ABRA可見于神經(jīng)元的胞核、胞漿、突起內(nèi)，提示ABRA可能在神經(jīng)系統(tǒng)中具有一定的作用［9］。在本實驗中我們對各年齡組腰段脊髓ABRA的表達進行了觀察，并發(fā)現(xiàn)不同年齡階段大鼠腰段脊髓中均檢測到ABRA的表達，且在不同年齡階段表達有變化，新生大鼠腰髓中ABRA蛋白水平表達最高，成年鼠及老年鼠表達下調(diào)且維持在一定的生理水平，推測ABRA作為ABPs新成員之一，可能與神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)其他ABPs一樣，如profilin［11］、tropomysin［12］等，通過調(diào)節(jié)actin絲的形態(tài)、長度，影響神經(jīng)細(xì)胞的生長、遷移及形態(tài)的改變，進而影響器官的發(fā)育，傷口的愈合等［13－15］。ABRA在新生大鼠腰髓中表達最強，這可能與大鼠發(fā)育早期神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分化等有關(guān)，至成年及老年仍維持在一定的生理水平，可能與ABRA參與調(diào)節(jié)actin的多聚化，維持成熟神經(jīng)元結(jié)構(gòu)功能的穩(wěn)定性有關(guān)的。

本實驗中免疫熒光染色顯示ABRA廣泛分布于各年齡組前角運動神經(jīng)元，推測ABRA可能與腰段脊髓前角運動神經(jīng)元的發(fā)育分化和出生后長期的神經(jīng)元生存維持作用有關(guān)。在后角，ABRA高表達于感覺神經(jīng)元，提示ABRA可能與外周感覺傳入有關(guān)。新生鼠ABRA＋Neu N雙陽性細(xì)胞占總ABRA陽性細(xì)胞百分比顯著低于成年組、老年組，提示ABRA在大鼠發(fā)育早期不僅表達在神經(jīng)元內(nèi)，可能還表達于非神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)，共同影響大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。

目前，有關(guān)ABRA與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的研究只是剛剛起步，深入研究ABRA與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)系對于重新認(rèn)識ABPs在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育作用及進一步闡述相關(guān)疾病的機制具有重要意義，本文的結(jié)果為探討ABRA在發(fā)育期腰段脊髓中的作用提供了一些形態(tài)學(xué)證據(jù)。ABRA在腰段脊髓表達及隨發(fā)育時段而變化的事實提示ABRA可能參與腰段脊髓的發(fā)育成熟、突觸的形成以及神經(jīng)可塑性調(diào)節(jié)過程。

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圖 版 說 明

圖1 Western blot檢測ABRA在新生鼠、成年鼠、老年鼠腰段脊髓中的表達變化1.新生鼠2.成年鼠3.老年鼠。GAPDH作為上樣對照。＊與成年鼠、老年鼠組相比P＜0.05。

圖2 免疫熒光雙標(biāo)顯示ABRA在新生鼠、成年鼠、老年鼠腰段脊髓前角中的分布A－A"：ABRA（綠）和 Neu N（紅）在新生鼠腰段脊髓前角的雙標(biāo)記B－B"：ABRA（綠）和 Neu N（紅）在成年鼠腰段脊髓前角的雙標(biāo)記C－C"：ABRA（綠）和 Neu N（紅）在老年鼠腰段脊髓前角的雙標(biāo)記Bar＝50μm 綠：ABRA 紅：Neu N

圖3 新生鼠、成年鼠、老年鼠腰段脊髓前角中ABRA＋Neu N雙陽性細(xì)胞占總ABRA陽性細(xì)胞百分比

＊與成年鼠、老年鼠組相比P＜0.05

圖4 免疫熒光雙標(biāo)顯示ABRA在新生鼠、成年鼠、老年鼠腰段脊髓后角中的分布

A－A”：ABRA（綠）和 Neu N（紅）在新生鼠腰段脊髓后角的雙標(biāo)記

B－B”：ABRA（綠）和 Neu N（紅）在成年鼠腰段脊髓后角的雙標(biāo)記

C－C”：ABRA（綠）和 Neu N（紅）在老年鼠腰段脊髓后角的雙標(biāo)記

Bar＝50μm 綠：ABRA 紅：Neu N

圖5 新生鼠、成年鼠、老年鼠腰段脊髓后角中ABRA＋Neu N雙陽性細(xì)胞占總ABRA陽性細(xì)胞百分比

＊與成年鼠、老年鼠組相比P＜0.05

圖6 ABRA亞細(xì)胞定位圖

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 The expression of ABRA during the lumbar spinal cord of newborn、adult and aged rats by Western blot 1，newborn rats；2，adult rats；3，aged rats.GAPDH served as a loading control.＊P＜0.05 vs adult and aged rats groups

Fig.2 Immunofluorescence double staining showed that the distribution of ABRA in the lumbar spinal cord anterior horn of newborn、adult and aged rats A－A"：Double－labeling of ABRA （green）and Neu N（red）in the lumbar spinal cord anterior horn of newborn rats B－B"：Double－labeling of ABRA （green）and Neu N（red）in the lumbar spinal cord anterior horn of adult rats C－C"：Double－labeling of ABRA （green）and Neu N（red）in the lumbar spinal cord anterior horn of aged rats Bar＝50μm green：ABRA red：Neu N

Fig.3 The percentage of ABRA＋Neu N double positive cells to total ABRA positive cell in the lumbar spinal cord anterior horn of newborn、adult and aged rats Note：＊P＜0.05 vs adult and aged rats groups

Fig.4 Immunofluorescence double staining showed that the distribution of ABRA in the lumbar spinal cord dorsal horn of newborn、adult and aged rats A－A”：Double－labeling of ABRA （green）and Neu N（red）in the lumbar spinal cord dorsal horn of newborn rats B－B”：Double－labeling of ABRA （green）and Neu N（red）in the lumbar spinal cord dorsal horn of adult rats C－C”：Double－labeling of ABRA （green）and Neu N（red）in the lumbar spinal cord dorsal horn of aged rats

Fig.5 The percentage of ABRA＋Neu N double positive cells to total ABRA positive cell in the lumbar spinal cord dorsal horn of newborn、adult and aged rats

Note：＊P＜0.05 vs adult and aged rats groups Fig.6 Subcellular location map of ABRA