非小細(xì)胞肺癌Survivin和Skp2的表達(dá)及其臨床意義

井昶雯， 曹海霞， 馬 蓉， 王 卓， 吳建中

肺癌是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的惡性疾病，發(fā)病率居惡性腫瘤的前列，并由于環(huán)境污染、吸煙等問(wèn)題，發(fā)病率不斷上升，5年生存率不足20%[1-2]。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌最常見(jiàn)的類(lèi)型。腫瘤的發(fā)生發(fā)展為多種因素共同作用的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程, 與癌基因及抑癌基因的異常密切相關(guān)。Survivin，也被稱為含桿狀病毒IAP重復(fù)序列分子5，是凋亡抑制家族成員之一。研究表明，Survivin能抑制細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)其增殖能力和促進(jìn)新生血管形成[3-4]。Survivin在多種人類(lèi)腫瘤中高表達(dá)[5]。S期激酶相關(guān)蛋白2(S-phase kinase associated protein 2,Skp2)屬于泛素化-蛋白酶體系統(tǒng)。Skp2通過(guò)對(duì)多種靶蛋白的泛素化降解而與細(xì)胞周期調(diào)控及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。Skp2調(diào)控的靶點(diǎn)包括周期素D1,E,P130,E2F1和周期素依賴性激酶抑制物p27,p21，p57[6]。本研究利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)和免疫組化技術(shù)檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌組織中Skp2和survivin mRNA和蛋白的表達(dá)情況以探討其臨床意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源及一般資料

收集我院2011年1月至2011年12月期間臨床病理資料完整的手術(shù)切除非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本共50例(均經(jīng)病理學(xué)確診),其中30例有對(duì)應(yīng)的癌旁組織(距癌組織5 cm以外的肺組織)。其中，男29例，女21例；年齡43～79歲，中位年齡60歲。根據(jù)1997年國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期22例， Ⅲ～Ⅳ期28例。中、高分化23例，低分化27例；鱗癌25例、腺癌25例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例。標(biāo)本均在手術(shù)時(shí)采集，標(biāo)本采集后迅速置液氮內(nèi)保存，然后轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑及引物

Trizol(Invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq酶、2×SYBR Green PCR Master Mix(Takara公司)，人抗Skp2抗體和Survivin抗體(北京中杉)。從基因庫(kù)中檢索survivin及β-actin的基因序列，根據(jù)Primer 5.0設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR引物序列，經(jīng)BLAST分析，確定其特異性。所有引物均由Takara公司合成。Survivin基因：上游引物 TGCGGGAATCCAAAGGATAATTCA；下游引物 CTTCATCTTTGTCATACTTCATGGCT。β-actin基因：上游引物 GATGAGATTGGCATGGCTTT；下游引物 CACCTTCACCGTTCCAGTTT。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 免疫組化及結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 采用Envision法，先用poly-L-lysine處理載玻片，做石蠟切片厚4 μm，60 ℃烘干處理1 h，常規(guī)脫蠟、水化組織切片；pH=6.0的檸檬酸修復(fù)液修復(fù)Survivin抗原，胰蛋白酶消化、修復(fù)處理Skp2抗原；用蒸餾水沖洗切片1次，再用PBS沖洗2次；為抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，用3%H2O2處理切片10 min，再用PBS沖洗3次；滴加一抗，4 ℃反應(yīng)過(guò)夜；PBS沖洗3次，滴加EnvisionTM反應(yīng)30 min，PBS沖洗切片3次；DAB顯色3～5 min；蘇木精對(duì)比復(fù)染，中性樹(shù)脂封固。

結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)以細(xì)胞的胞質(zhì)或胞核內(nèi)出現(xiàn)明顯的棕黃色或黃褐色顆粒染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別計(jì)分，積分之和來(lái)判斷。按染色強(qiáng)度記為0～3分，不著色為0分，著色輕度為1分，中度為2分，著色較強(qiáng)為3分。按染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)記為0～4分，無(wú)細(xì)胞著色為0分，<25%細(xì)胞為l分，25%～50%細(xì)胞為2分，50%～75%細(xì)胞為3分，>75%的細(xì)胞著色為4分。陰性表達(dá)為染色指數(shù)0～2分，陽(yáng)性表達(dá)為3～7分。

1.3.2 實(shí)時(shí)定量PCR 采用Trizol法從組織中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄1 μg總RNA得到cDNA，以cDNA為模板用ABI 7300進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增出目的片段Survivin和β-actin。整個(gè)反應(yīng)體系20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火31 s，40個(gè)循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，相關(guān)性檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為L(zhǎng)og-rank檢驗(yàn)，以雙側(cè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 非小細(xì)胞肺癌和癌旁組織中survivin mRNA表達(dá)情況

在30組NSCLC腫瘤組織和對(duì)應(yīng)的癌旁組織中，23組腫瘤組織中survivin mRNA表達(dá)量明顯高于癌旁組織(P<0.01)。

2.2 非小細(xì)胞肺癌組織中Survivin和Skp2的表達(dá)

在50例NSCLC癌組織中Survivin陽(yáng)性例數(shù)為37例，陽(yáng)性率為74.0%，Skp2的陽(yáng)性例數(shù)為35例，陽(yáng)性率為70.0%。在30例癌旁組織中，Survivin和Skp2的陽(yáng)性表達(dá)率分別為16.7%(5/30)和20.0%(6/30)。Survivin在NSCLC癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁組織(χ2=25.9，P<0.001)。而NSCLC癌組織中Skp2陽(yáng)性表達(dá)率也顯著高于其在癌旁組織的表達(dá)(χ2=18.8，P<0.001)，見(jiàn)表1。

表1 NSCLC中Survivin和Skp2的表達(dá)情況

2.3 Survivin表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系

我們對(duì)50例NSCLC中Survivin表達(dá)和病理類(lèi)型的關(guān)系進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。在此研究中，Survivin的表達(dá)與病理類(lèi)型(χ2=0.94，P>0.05)、分化程度高低(χ2=0.4，P>0.05)、腫瘤分期(χ2=0.03，P>0.05)及是否伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=0.02，P>0.05)無(wú)相關(guān)性。詳見(jiàn)表2。

表2 Survivin表達(dá)與NSCLC病理特征的關(guān)系

2.4 NSCLC癌組織中Survivin和Skp2表達(dá)的關(guān)系

35例Skp2表達(dá)陽(yáng)性的NSCLC癌組織中，Survivin也陽(yáng)性的有30例(85.7%，30/35)。而Skp2表達(dá)為陰性的癌組織中，Survivin的陽(yáng)性率為46.7%(7/15)。兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明在NSCLC中Survivin表達(dá)與Skp2表達(dá)有相關(guān)性。見(jiàn)表3。

表3 NSCLC癌組織中Survivin和Skp2表達(dá)的關(guān)系

3 討論

Survivin這個(gè)凋亡抑制蛋白首次由耶魯大學(xué)利用效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體cDNA 篩選人基因組文庫(kù)獲得。作為最小的凋亡蛋白抑制因子，在抑制細(xì)胞凋亡的過(guò)程中充當(dāng)著重要的角色[7]。Survivin在宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、肺癌、腎癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，而在一般組織中無(wú)表達(dá)[8]。本研究結(jié)果也證實(shí)NSCLC癌組織中的survivin mRNA表達(dá)量明顯高于癌旁組織；Survivin陽(yáng)性表達(dá)率(74.0%)也明顯高于癌旁組織的陽(yáng)性表達(dá)率。

Survivin 的表達(dá)水平、定位和NSCLC的組織類(lèi)型、細(xì)胞分化凋亡程度、TNM分期、侵襲轉(zhuǎn)移，以及患者存活時(shí)間、預(yù)后有關(guān)，但各研究結(jié)果存在不一致性。有研究發(fā)現(xiàn)Survivin是肺癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素，其表達(dá)水平與TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[9]。但也有研究表明Survivin 表達(dá)與腫瘤分期相關(guān)，但不影響患者的生存率[10]。Survivin在女性乳腺癌組織、乳腺增生組織的陽(yáng)性表達(dá)率分別為76.3%、25.0%，而在纖維瘤旁正常乳腺組織中不表達(dá)，且Survivin 陽(yáng)性表達(dá)率與乳腺癌TNM分期有關(guān)，與病理類(lèi)型無(wú)關(guān)[11]。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)不同定位的Survivin與預(yù)后的關(guān)系不同，細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)Survivin的肺癌患者中位生存期短，是肺癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素，而胞漿中的Survivin與預(yù)后無(wú)關(guān)[12]。本實(shí)驗(yàn)中survivin mRNA在NSCLC組織中的表達(dá)與腫瘤病理類(lèi)型、細(xì)胞分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的相關(guān)性，原因可能是檢測(cè)方法、樣本例數(shù)不同。

Skp2基因定位于人5號(hào)染色體短臂上，分子質(zhì)量約45 KD。Skp2屬于泛素化-蛋白酶體系統(tǒng)，Skp2作為泛素連接酶E3中的組成部分——F盒蛋白，識(shí)別并結(jié)合多種周期素蛋白和周期素依賴性激酶抑制物對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)控。Skp2在多種腫瘤中表達(dá)明顯升高，包括消化道腫瘤、乳腺癌、肺癌等。有研究發(fā)現(xiàn)Skp2在肺癌組織中表達(dá)明顯升高，特異性小干擾RNA片段下調(diào)Skp2表達(dá)可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，明顯抑制細(xì)胞增殖[13]。另有研究通過(guò)RT-PCR及免疫組化法檢測(cè)了79例非小細(xì)胞肺癌的Skp2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Skp2的表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、脈管內(nèi)癌栓、組織學(xué)分級(jí)及生存率相關(guān)[14]。本研究顯示在50例非小細(xì)胞肺癌組織中，Skp2的陽(yáng)性例數(shù)為35例，陽(yáng)性率為70.0%，明顯高于癌旁組織的陽(yáng)性率20.0%。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)在Skp2表達(dá)陽(yáng)性的非小細(xì)胞肺癌組織中Survivin陽(yáng)性表達(dá)率亦明顯升高，兩者呈正相關(guān)。說(shuō)明兩者可能在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著一定的協(xié)同作用。

總之，我們的研究顯示在非小細(xì)胞肺癌中Survivin存在過(guò)度表達(dá)現(xiàn)象，提示其在NSCLC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用；Survivin的表達(dá)與Skp2表達(dá)密切相關(guān)，但要深入探討二者的關(guān)系還需要進(jìn)一步的研究。

[1] Jemal A,Siegel R,Xu J, et al.Cancer statistics,2010[J].CA Cancer J Clin,2010,60(5):277-300.

[2] Molina JR,Yang P,Cassivi SD,et al.Non-small cell lung cancer: epidemiology, risk factors, treatment, and survivorship[J].Mayo Clin Proc,2008,83(5):584-594.

[3] Samuel T,Okada K,Hyer M,et al.cIAP1 Localizes to the nuclear compartment and modulates the cell cycle[J].Cancer Res,2005,65(1):210-218.

[4] Tran J,Master Z,Yu JL,et al.A role for Survivin in chemoresistance of endothelial cells mediated by VEGF[J].Proc Natl Acad Sci USA ,2002,99(7):4349-4354.

[5] Sah NK,Khan Z,Khan GJ,et al.Structural,functional and therapeutic biology of Survivin[J]. Cancer Lett,2006,244(2):164-171.

[6] Skowyra D,Craig KL,Tyers M,et al.F-box proteins are receptors that recruit phosphorylated substrates to the SCF ubiquitin-ligase complex[J].Cell ,1997,91(2):209-219.

[7] Altieri DC.Survivin,cancer networks and pathway-directed drug discovery[J].Nat Rev Cancer,2008,8(1):61-70.

[8] Kelly RJ,Lopez-Chavez A,Citrin D,et al.Impacting tumor cell-fate by targeting the inhibitor of apoptosis protein Survivin[J].Mol Cancer,2011,10:35.

[9] Akyurek N,Memis L,Ekinci O,et al.Survivin expression in pre-invasive lesions and non-small cell lung carcinoma[J].Virchows Arch,2006,449(2):164-170.

[10] Falleni M,Pellegrini C,Marchetti A,et al.Survivin gene expression in early-stage non-small cell lung cancer[J].J Pathol,2003,200(5):620-626.

[11] 王昌亮，鄭春輝，王在國(guó).Survivin 在乳腺癌中的表達(dá)及意義[J].中國(guó)腫瘤外科雜志,2012,4(1): 56-57.

[12] Bria E,Visca P,Novelli F,et al.Nuclear and cytoplasmic cellular distribution of Survivin as survival predictor in resected non-small-cell lung cancer[J].Eur J Surg Oncol,2008,34(5) : 593-598.

[13] Yokoi S,Yasui K,Iizasa T,et al.Down-regulation of SKP2 induces apoptosis in lung-cancer cells[J].Cancer Sci,2003,94(4):344-349.

[14] Takanami I.The prognostic value of overexpression of Skp2 mRNA in non-small cell lung cancer[J].Oncol Rep,2005,13 (4):727-731.