透明質(zhì)酸的功能、制備及其在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

摘 要 透明質(zhì)酸是一種天然的線性黏多糖，具有特殊生理功能。本文簡(jiǎn)介透明質(zhì)酸的功能、各種制備方法以及在醫(yī)學(xué)方面的進(jìn)展。

關(guān)鍵詞 透明質(zhì)酸 功能 制備 治療

中圖分類號(hào)：R91; R96; TQ464.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-1533(2012)15-0046-06

The function， preparation and medical application of hyaluronan

DU Ping- zhong

(Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry， Shanghai 200040， China)

ABSTRACT Hyaluronan is a natural linear mucopolysaccharide which possesses the special physiological functions. This review briefly introduces the functions， preparations of hyaluronan and its progress applied in medicine.

KEY WORDS hyaluronan; function; preparation; therapy

透明質(zhì)酸又名玻璃酸（hyaluronan或hyaluronic acid，HA），是Meyer等[1]于1934年從牛玻璃體分離獲得并命名。由于HA是人體皮膚、關(guān)節(jié)軟骨等組織的天然組分，又在人體的生理代謝中具有特殊功能，近年來(lái)受到人們愈來(lái)愈多的關(guān)注，在醫(yī)學(xué)、藥學(xué)和化妝保健品方面得到廣泛的開發(fā)和應(yīng)用。據(jù)估計(jì)HA銷售在國(guó)際上超過10億美元，在大大地促進(jìn)HA的研發(fā)和生產(chǎn)。本文對(duì)HA功能、生產(chǎn)和醫(yī)療保健方面的應(yīng)用進(jìn)展作一概述。

1 透明質(zhì)酸的性質(zhì)與功能

1.1 HA的分布

HA是由β-3-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和β-1，4-葡萄糖醛酸（GlcA）雙糖重復(fù)單位構(gòu)成的線性黏多糖。HA在自然界中分布廣泛，是細(xì)胞外基質(zhì)組份，哺乳動(dòng)物的結(jié)締組織，關(guān)節(jié)滑液、皮膚、眼玻璃體、臍帶以及雞冠、鯨魚軟骨、鯊魚皮、海藻、軟體動(dòng)物都含有HA，在原核細(xì)胞中它以黏性莢膜存在。在人體中，皮膚含7～8 g HA，占總量的50%以上，臍帶和關(guān)節(jié)滑液HA含量也很豐富[2，3]（表1）。

1.2 HA的性質(zhì)

HA為白色無(wú)定形或纖維狀物資，無(wú)臭，有強(qiáng)吸濕性，易溶于水，不溶于醇、酮、乙醚等有機(jī)溶劑，水溶液呈酸性，帶負(fù)電。

HA經(jīng)酸堿或加熱處理，易引起分解，在還原劑，氧自由基，紫外線，X射線或超聲波等的作用下，可使其低分子化。HA還易被透明質(zhì)酸酶和硫酸軟骨素酶等分解[5]。

1.3 HA的保水性

HA含有多個(gè)羥基和羧基，能與水分子形成氫鍵，有強(qiáng)大的保水作用，理論保水值達(dá)500 ml/g。它的保水性與甘油等一般保濕劑不同，不易受外界環(huán)境影響，不論在低濕度還是高濕度條件下，吸濕性大致相同，因此，HA是一種理想的保濕劑，保濕效果與分子量大小有關(guān)，分子量越大保濕效果越好。皮膚保健就是利用這一特性[6]。

1.4 HA的黏彈性

HA在低濃度時(shí)，以線狀形式存在，在高濃度時(shí)（1%），分子以網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)存在，有很高的黏彈性。分子量約200萬(wàn)0.2%水溶液黏度為1 000 CPS，當(dāng)濃度增至1%時(shí)，其黏度增加1 000倍。黏度大小還受分子量、pH和離子強(qiáng)度等因素影響[5]。

1.5 HA的流變性

在溶液中，HA線性分子骨架內(nèi)部氫原子形成非極性疏水面，外部側(cè)鏈形成親水面，出現(xiàn)一種扭曲的盤旋帶狀結(jié)構(gòu)，具有很獨(dú)特的流變性質(zhì)，超常的潤(rùn)滑性和很強(qiáng)的親水性。在低濃度時(shí)，有異常的流變性，在較高濃度時(shí)，有極高但依存剪切的黏度。1% HA溶液象凍膠，但在壓力下，它很容易通過小針孔，被稱為“假塑性材料”。HA溶液獨(dú)特的流變性質(zhì)使它成為理想的潤(rùn)滑劑，已成功地用于防止手術(shù)后黏連[7]。

1.6 HA的生理功能

HA是細(xì)胞外基質(zhì)的必需組份，參與和中介細(xì)胞信號(hào)傳遞，傷口修復(fù)，形態(tài)發(fā)生和基質(zhì)組織等生理活動(dòng)，它能調(diào)節(jié)與巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞相互作用。在高濃度下，HA抑制巨噬細(xì)胞的增殖、移行和吞噬能力，在低濃度下，它反而增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬和胞飲能力。對(duì)淋巴細(xì)胞，它抑制宿主對(duì)移植物反應(yīng)，阻止其增殖[7]。它參與細(xì)胞的分化調(diào)控，與腫瘤的轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系[3]。

HA是帶酸性基團(tuán)的生物大分子，對(duì)細(xì)胞外的Ca2+、Mg2+、Na+、K+等陽(yáng)離子有較大親和力，能調(diào)節(jié)這些陽(yáng)離子在細(xì)胞表面及其周圍的變化。HA分子可任意卷曲形成三維空間網(wǎng)絡(luò)，具有分子篩功能，小分子易通過，大分子則受阻，起著調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的功能[2]。

1.7 HA的安全性

HA是人體結(jié)締組織的主要成分，與蛋白質(zhì)結(jié)合存在于機(jī)體各組織內(nèi)，本身有極高安全性，大鼠急性毒性LD50：口服500 mg/kg，皮下和腹腔注射2 000 mg/kg。它無(wú)抗原性，無(wú)過敏反應(yīng)，無(wú)致畸、致突變和致癌作用[6，7]。這表明HA安全可靠，不僅可作為醫(yī)藥用品，而且還可作為保健化妝品基質(zhì)，得到廣泛的應(yīng)用。

2 透明質(zhì)酸的制備

由于HA的優(yōu)良性能以及它在醫(yī)療和保健化妝品上的廣闊應(yīng)用前景，人們一直在研究和開發(fā)HA的各種制備方法，從傳統(tǒng)的提取法發(fā)展到微生物發(fā)酵法，直至用基因重組技術(shù)，改造原有菌種或構(gòu)建新的微生物產(chǎn)生菌，都取得顯著的進(jìn)展。

2.1 動(dòng)物組織提取法

在機(jī)體組織中，HA幾乎都與蛋白質(zhì)以共價(jià)鍵結(jié)合成蛋白聚糖，通常雞冠、人臍帶、?；蜇i眼玻璃體和皮膚等含量較高，作為起始原料，經(jīng)機(jī)械切塊破碎后，用堿或蛋白酶降價(jià)，使HA與蛋白質(zhì)分離，用氯仿等有機(jī)溶劑去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)，其溶液經(jīng)乙醇多次沉淀，再經(jīng)氯化十六烷基吡啶和無(wú)菌處理等精制過程，得到無(wú)菌無(wú)熱源高純度HA制品[2]。提取時(shí)，要防止透明質(zhì)酸酶和加溫使HA降解低分子化。雞冠等提取工藝耗時(shí)費(fèi)力，勞動(dòng)強(qiáng)度大，生產(chǎn)成本高，易受HA降解酶影響，制造高純度高分子量產(chǎn)品很困難，而且動(dòng)物來(lái)源大分子有跨種間風(fēng)險(xiǎn)和病毒污染可能，面臨著日益增長(zhǎng)的反對(duì)，從20世紀(jì)80年代起，微生物發(fā)酵法逐漸興起，大有替代提取法之勢(shì)。

1980年瑞典Pharmacia公司首先從雞冠制備出醫(yī)用級(jí)HA，占領(lǐng)市場(chǎng)，之后日本、中國(guó)等國(guó)相繼開發(fā)出同類產(chǎn)品，參與競(jìng)爭(zhēng)。

2.2 微生物發(fā)酵法

能合成HA的微生物主要有溶血性鏈球菌，1937年報(bào)道鏈球菌A群產(chǎn)生HA，之后發(fā)現(xiàn)鏈球菌C群也產(chǎn)生HA，HA存在于鏈球菌的莢膜上，為細(xì)菌提供一種隱蔽功能，使機(jī)體免疫系統(tǒng)不能識(shí)別，免受白細(xì)胞的攻擊。A群和C群鏈球菌分別為人和動(dòng)物的致病菌，前者對(duì)人危害大，不適合生產(chǎn)，后者雖對(duì)動(dòng)物致病，但經(jīng)誘變選育出低毒菌株，可在嚴(yán)格控制下生產(chǎn)，常用的生產(chǎn)菌株(表2)是馬鏈球菌、獸疫鏈球菌和類馬鏈球菌的突變株[5，8]。

與提取法相比，發(fā)酵法工藝比較簡(jiǎn)單，HA以游離態(tài)分泌到發(fā)酵液中，不含難以分離的蛋白質(zhì)和其他黏多糖，容易得到高純度高分子量的HA，適合于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。常用的生產(chǎn)菌株為獸疫鏈球菌和馬鏈球菌的突變株。1982年日本資生堂開始研究發(fā)酵法，1985年開發(fā)成功，突變株的HA產(chǎn)量大于5 mg/ml，達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)要求[5]。典型的HA發(fā)酵過程是以葡萄糖為主要碳源，在含蛋白胨、酵母膏、磷酸鹽和硫酸鹽等成分的培養(yǎng)基中，在34～37 ℃，pH 7及通氣攪拌條件下，經(jīng)過30～48 h發(fā)酵，HA產(chǎn)量可達(dá)5～7 mg/ml.。發(fā)酵液離心去菌體，加沉淀劑去蛋白質(zhì)，溶液加乙醇沉淀HA，再經(jīng)氯化十六烷基吡啶、超濾、透析和離子交換等技術(shù)處理，去除微量雜質(zhì)熱源，制得高純度醫(yī)用級(jí)HA[2]。

HA的發(fā)酵受到菌種、基因、培養(yǎng)基和發(fā)酵過程各種參數(shù)的影響。首先，現(xiàn)在HA生產(chǎn)菌種多為動(dòng)物致病菌，菌種本身可能分泌透明質(zhì)酸酶使HA水解，并產(chǎn)生β-溶血素，菌種經(jīng)NTG等誘變劑處理和一系列選育，以獲得無(wú)HA水解酶和溶血素的HA高產(chǎn)菌株。其次，培養(yǎng)基的組成也十分重要，鏈球菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)有特殊要求，尤其是營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，氮源（酵母膏，蛋白水解液），碳源（葡萄糖，蔗糖）以及二價(jià)金屬離子(Mg2+、Mn2+)等適當(dāng)配合，以求獲得最佳組合。第三，發(fā)酵參數(shù)的調(diào)控，pH，溶解氧，攪拌轉(zhuǎn)速和型式，菌濃度和糖氮消耗等進(jìn)行優(yōu)化組合，由于HA發(fā)酵液的高黏性，影響氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳遞，這樣，HA的產(chǎn)量達(dá)5～7 g/L已接近極限[2，8]。

目前，發(fā)酵法生產(chǎn)HA占主導(dǎo)地位，日本，歐美和中國(guó)都已規(guī)?；a(chǎn)，產(chǎn)品的競(jìng)爭(zhēng)也日趨劇烈。

2.3 基因重組菌種發(fā)酵法

最近十幾年，有關(guān)鏈球菌基因測(cè)序和代謝工程研究取得很大進(jìn)展，為構(gòu)建基因重組菌種打下基礎(chǔ)。HA生產(chǎn)來(lái)自動(dòng)物組織或致病菌發(fā)酵，給安全生產(chǎn)帶來(lái)一定風(fēng)險(xiǎn)，美國(guó)FDA和歐洲EMEA對(duì)其生產(chǎn)工藝有嚴(yán)格限制。20世紀(jì)90年代起，美歐日等國(guó)投入巨資，探索用基因工程技術(shù)構(gòu)建非致病菌，開辟了一條轉(zhuǎn)基因HA生產(chǎn)新途徑，近年來(lái)取得突破性的進(jìn)展，有的已經(jīng)產(chǎn)業(yè)化?？莶輻U菌等轉(zhuǎn)基因HA產(chǎn)生菌屬于一般認(rèn)為安全認(rèn)證（GRAS）的菌種，特點(diǎn)是安全性高，無(wú)病毒污染或傳播動(dòng)物病原菌的風(fēng)險(xiǎn)，宿主不產(chǎn)生任何內(nèi)外毒素，且培養(yǎng)條件要求低，發(fā)酵產(chǎn)生的HA直接分泌到培養(yǎng)基中。表3列出HA基因重組菌種等。

枯草桿菌是具有生物合成HA能力的革蘭陽(yáng)性菌，除沒有透明質(zhì)酸合成酶外，含有所有必需的酶系。鏈球菌生物合成HA的關(guān)鍵酶，在枯草桿菌中都有類似的酶。例如，HA產(chǎn)生菌類馬鏈球菌有透明質(zhì)酸合成酶基因（hasA），合成HA前體所需的關(guān)鍵酶基因，UDP-葡萄糖脫氫酶基因（hasB），UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因（hasC），UDP-N-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶基因（hasD），與天然枯草桿菌相應(yīng)前體基因分別為tuaD (hasB類似物)，gtaB（hasC），gcaD (hasD) （圖1）。將鏈球菌的hasA與枯草桿菌一個(gè)或多個(gè)tuaD，gtaB，gcaD作為基因盒整合到枯草桿菌A164D5的amyE所在的染色體上，可獲得高基因穩(wěn)定性。HA合成過程如圖2[15]，與尿苷二磷酸（UDP）結(jié)合的GlcNAc和GlcA單糖進(jìn)入細(xì)胞膜上透明質(zhì)酸酶內(nèi)交替轉(zhuǎn)位連接到線性HA上，之后分泌到細(xì)胞外。該菌株在以蔗糖為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基中發(fā)酵，產(chǎn)生HA分子量約100萬(wàn)，且低分散度，質(zhì)量好，工藝簡(jiǎn)單且環(huán)保[8，10]。這表明基因工程法雖然產(chǎn)量不及發(fā)酵法，但鑒于基因技術(shù)和代謝工程的優(yōu)勢(shì)，生產(chǎn)工藝安全，產(chǎn)品有保證，前景看好。

3 透明質(zhì)酸在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

HA具有獨(dú)特的高吸濕性和黏彈性，良好的生物相容性，無(wú)免疫原性以及降解產(chǎn)物安全等性質(zhì)，并有多種生理調(diào)節(jié)功能，因此，它的應(yīng)用領(lǐng)域在不斷擴(kuò)大。僅在醫(yī)學(xué)范圍里，其在眼科，耳鼻喉科，骨科，外科，皮膚科，整形科，組織工程等方面的應(yīng)用均有報(bào)道。在藥學(xué)中，除了用作藥物治療外，還可用作藥物載體，調(diào)節(jié)和控制藥物的吸收與釋放。在美容保健化妝品行業(yè)，更成為一種常用不可缺失的基質(zhì)。由于HA在機(jī)體里易被透明質(zhì)酸酶或自由基降解，半衰期幾小時(shí)到幾天，不能滿足外科，皮膚科和組織工程等的臨床需求，一些HA的衍生物和交聯(lián)物已開發(fā)成功，并開始用于臨床。

3.1 眼科

20世紀(jì)80年代，瑞典Pharmacia公司首先將HA產(chǎn)品作為眼外科手術(shù)填充劑應(yīng)用于臨床，目前，HA在白內(nèi)障摘除、人工晶體植入、角膜移植、視網(wǎng)膜脫離等稱為眼科黏性外科手術(shù)中得到普遍應(yīng)用[16]，到2009年至少2 500萬(wàn)患者從中得益。HA在手術(shù)中滯留于前房，保持手術(shù)視野清晰，保護(hù)角膜內(nèi)皮和虹膜組織，減少術(shù)間出血和損傷，降低術(shù)后炎癥，提高手術(shù)成功率。HA對(duì)角膜有保護(hù)作用，與纖連蛋白結(jié)合，促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞連接和延伸，加快角膜創(chuàng)傷愈合。近來(lái)報(bào)道，HA與羥丙甲基纖維素二元組合制劑更適合眼科手術(shù)[17]。

以HA為主要成分的滴眼藥液，具有強(qiáng)親水能力和潤(rùn)滑作用，可穩(wěn)定淚膜，延長(zhǎng)淚液破裂時(shí)間，防止角膜和結(jié)膜干燥，減輕眼組織摩擦，緩解干眼癥的不適癥狀，用于治療干燥綜合癥，眼干燥癥，以及手術(shù)、外傷和配戴隱形眼鏡所致的角膜結(jié)膜上皮損傷，也用于改善隱形眼鏡配戴舒適度[17]。

3.2 耳鼻喉科

鼓膜穿孔是由中耳感染、外傷等引起的，尤其對(duì)兒童學(xué)習(xí)語(yǔ)言有很大影響。HA制劑以及衍生物直接滴入鼓膜穿孔患者中耳內(nèi)，可加快穿孔鼓膜的閉合，改善疤痕質(zhì)量，縮短愈合時(shí)間，產(chǎn)生新鼓膜，改進(jìn)聽力，且對(duì)耳蝸無(wú)毒性[18]。這是一種技術(shù)簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)省時(shí)的方法，適合于干性鼓膜穿孔患者的鼓膜成形術(shù)。目前，還需進(jìn)行大規(guī)模隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)后，才能確保HA常規(guī)使用[19]。

在聲帶襞瘢痕治療上，HA交聯(lián)后有希望用于聲帶開始損傷時(shí)防止瘢痕生成，而對(duì)已形成的瘢痕可使固有膜復(fù)原，但其療效仍需進(jìn)一步確認(rèn)[20]。

3.3 骨科

HA注入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，增強(qiáng)關(guān)節(jié)液的潤(rùn)滑功能，促進(jìn)軟骨的愈合與再生，抑制疼痛，減少炎癥，用于治療各種骨關(guān)節(jié)炎取得較好療效[21，22]。另外，在退行性關(guān)節(jié)炎和整形科領(lǐng)域，如對(duì)椎間盤退化的修復(fù)與再生，HA能促進(jìn)軟骨細(xì)胞分化，維持椎間盤和骨髓基底細(xì)胞活性，也顯示出治療潛力[23]。

3.4 外科

在腹部手術(shù)后，腹腔黏連并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)約為29.7%，最常見的并發(fā)癥是小腸梗阻，病人需重新入院治療。HA作為基質(zhì)的抗黏連劑，可使手術(shù)時(shí)暴露在空氣中器官組織保持水分，減少或防止相互黏連。機(jī)理是在受損的腹腔表面HA進(jìn)行機(jī)械隔離，也有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的作用。HA-CMC(羧甲基纖維素)制成的無(wú)菌可生物再吸收的抗黏連膜，1996年美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于腹腔手術(shù)防黏連，如經(jīng)腹腔鏡治療潰瘍性腸炎，家族性結(jié)腸息肉，子宮肌瘤切除和疝修復(fù)等都很有前途[24]。

3.5 皮膚科

HA用于燒傷、創(chuàng)傷或皮膚潰瘍治療時(shí)，涂敷在傷面上，形成一層薄膜，既可免受細(xì)菌感染，又可透氣保持創(chuàng)面干燥；低分子HA還能滲透到真皮層，促進(jìn)上皮再生，促進(jìn)愈合。HA局部用于治療急性放射上皮炎，腿靜脈潰瘍和糖尿病腳等[25]。

3.6 組織工程

HA是細(xì)胞外基質(zhì)的必需成分，由于它無(wú)毒、極好的生物相容性和降解性[26]。在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中，以HA為基礎(chǔ)的生物材料，構(gòu)建成合成的細(xì)胞外基質(zhì)，作為支架和載體，參與干細(xì)胞傳遞，生長(zhǎng)分化，組織修復(fù)，形態(tài)生成等生理活動(dòng)，成為制造新型機(jī)體組織最重要的建筑塊[27]。如從皮膚、肝臟、心肌、軟骨和神經(jīng)等組織獲得的先祖細(xì)胞和成熟細(xì)胞，可按規(guī)格定制培育出所需的組織與器官[28，29]。

3.7 藥物傳輸系統(tǒng)

HA是多種生理功能的天然線性多糖，不僅用于組織工程前景廣闊，而且作為藥物載體也進(jìn)展迅速。HA及其各種衍生物、交聯(lián)物制成液體、凝膠、微粒和膜等劑型，可將生物活性小分子或蛋白多肽大分子，通過局部給藥，注射，植入等方式將藥物送至疾病部位，達(dá)到藥物緩釋或控釋的目的[30，31]。HA與腫瘤細(xì)胞上過表達(dá)的CD44受體親和力較強(qiáng)，有望成為癌癥靶向治療的手段[31]。美歐國(guó)家批準(zhǔn)HA作為雙氯芬酸鈉的藥物載體，明顯延長(zhǎng)藥物半衰期，局部治療光化角化病、骨關(guān)節(jié)炎、基底細(xì)胞癌等[32]。

3.8 保健化妝品

HA優(yōu)良的吸濕性，對(duì)皮膚又無(wú)毒無(wú)刺激，能清除自由基，幾乎所有各種化妝品如乳劑、霜?jiǎng)?、唇膏、香波和浴劑等都含有HA。它有助于皮膚水化，吸收水分，形成薄膜，滲透到上皮中去，還可防止皮膚免受紫外輻射[33]。皺紋是由于皮膚老化和HA丟失引起的，2003年美國(guó)FDA批準(zhǔn)HA注射液用于去除臉部的皺紋，填充軟組織缺損，增加皮下空間，減少皺紋深度，使臉部平滑[34]。

4 結(jié)語(yǔ)

HA是一種黏性高分子的多糖，在現(xiàn)有的生物提取法，發(fā)酵法和基因工程法中，后二者在工藝路線，產(chǎn)品安全和生產(chǎn)成本上具有更大的優(yōu)勢(shì)。HA優(yōu)良的生物理化特性和多種多樣的生理功能，使其在醫(yī)藥保健領(lǐng)域里得到廣泛的應(yīng)用，它的各種衍生物將成為組織工程和藥物傳輸系統(tǒng)中所需的新型生物材料和載體。

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（收稿日期2012-06-30）