泥炭水解液培養(yǎng)米曲霉的研究

摘要：本實(shí)驗(yàn)研究了泥炭水解液對米曲霉滬釀3.042的孢子生長速度以及種曲蛋白酶活性和成曲蛋白酶活性的影響。

關(guān)鍵詞：泥炭酸（水）解液——peat水解液 生長速率——The rate of growth 蛋白酶酶活——The activity of protein

1 概述

泥炭是不完全分解的植物殘?bào)w堆積物。因?yàn)樗遣煌耆纸猱a(chǎn)物的堆積物。其成份相當(dāng)復(fù)雜：水、纖維素、半纖維素、腐殖酸、石蠟，還有少量游離的氨基酸與金屬離子。通過不同的酸，不同濃度的酸進(jìn)行酸解，所得的泥炭水解液的成份及其組成含量均不盡相同，即使是用同一種酸、同種濃度，也會(huì)因?yàn)樘幚頃r(shí)間與處理的程序不同，泥炭水解液的成份及含量也有所差異。

對于泥炭的開發(fā)利用，在國外，是作為發(fā)酵工業(yè)基質(zhì)原料來培養(yǎng)微生物，目前主要限于酵母菌和食用菌的某些種屬；在國內(nèi)，早些時(shí)候，對泥炭的開發(fā)與利用，主要是將之作為一種建筑材料加以利用；目前，也曾有報(bào)道：泥炭水解液作為一些食用菌的發(fā)酵底物、熱帶假絲酵母生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白（scp）。在這些對于泥炭的開發(fā)利用中，泥炭水解液是作為碳源，將之添加到培養(yǎng)基質(zhì)中去的，且結(jié)果有一定程度的增產(chǎn)作用。我們觀察了泥炭水解液對米曲霉孢子發(fā)芽率、生長速率以及蛋白酶酶活的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

2 材料與方法

2.1 菌種：滬釀3.042米曲霉，安徽大學(xué)生命科學(xué)院菌種室提供。

2.2 泥炭：采自安徽省繁昌縣。

2.3 培養(yǎng)基

2.3.1 （斜面）培養(yǎng)基：參照《發(fā)酵調(diào)味品生產(chǎn)技術(shù)》（上冊）。

2.3.2 三角瓶種曲培養(yǎng)基：豆餅：麩皮=20：80，含水量與干料100%。

2.3.3 成曲培養(yǎng)基：同2.3.1——麩曲培養(yǎng)基：10豆餅/1麩皮。

2.4 泥炭水解液制備：參考A.M.Martin等人的方法。

2.5 細(xì)胞培養(yǎng)：二次活化，再低濃度梯度，peat水解液培養(yǎng)訓(xùn)化，最后三角瓶擴(kuò)大，成曲制備等實(shí)驗(yàn)。

2.6 試驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)按泥炭水解液含量分6個(gè)試驗(yàn)組種曲，成曲培養(yǎng)基中泥炭水解液含量分別為：0%、10%、15%、20%、25%、30%。

2.6.1 種曲接種：取7支經(jīng)訓(xùn)化階段的30%度管菌種，再支加無菌水3ml，輕劃后倒入無菌玻璃珠三角瓶制成孢基液，以接種量為1ml/支（三角瓶）接種到含peat水解液的試驗(yàn)組；取3支同樣階段的對照試管菌種，重復(fù)上述步驟，以相同接種量接種至對照組。29-31℃培養(yǎng)，18.5h第一次翻曲，24h第二次翻曲，再培養(yǎng)2天即可。

2.6.2 成曲接種：分別取對照，30%的種曲5g于無菌水+玻珠的三角瓶內(nèi)制成孢基液，對應(yīng)接種，接種量為1ml/支（三角瓶）30-25℃培養(yǎng)，11.5h第一次翻曲，18h第二次翻曲，27h成曲成熟。

2.6.3 種曲蛋白酶活測定時(shí)的接種量同2.6.2，30-35℃培養(yǎng)，18h第一次翻曲，24.5h第二次翻曲，繼續(xù)培養(yǎng)至66h即可。

2.6.4 酶活測定：參照Folin法測蛋白酶活，在40℃下，每分鐘水解絡(luò)蛋白產(chǎn)生1mg絡(luò)氨酸，定義為1個(gè)蛋白酶活力單位。

蛋白酶活力單位=A/10×4N

其中A為樣品測得的OD值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的酷氨酸的微克數(shù)。

10克為反應(yīng)時(shí)間是10分鐘。

4為4ml反應(yīng)液中取1ml測來（即4倍）。

N為酶液稀釋倍數(shù)。

3 結(jié)果與討論

3.1 peat水解液對滬釀3.042生長速度影響：

注：表1中長度指的是孢子平面向下延伸的長度。

從表1可看出隨時(shí)間的延長，孢子平面向下加快延伸，但后一階段增長百分比一般比前一階段增長百分值低，這與越向下，培養(yǎng)基通氣情況越差有關(guān)；隨peat水解液含量的增加，延長速率也加快，說明peat水解液對3.042的生長速率有較明顯的刺激作用。

3.2 peat水解液對3.042蛋白酶活性影響。

3.2.1 peat水解液對于3.042種曲蛋白酶活影響

種曲蛋白酶的多少雖與最后的發(fā)酵關(guān)系不大，但它活性大小可反映種曲的質(zhì)量，也一定程度上反映出種曲的孢子數(shù)多少；考慮種曲中提取高活性的蛋白酶用于后期發(fā)酵，以縮短發(fā)酵周期，改善醬油風(fēng)味等方面提供一條思路。

從表2可看出此種種曲蛋白酶（中性）酶活多數(shù)在2-3×103單位之間，且隨peat水解液濃度的升高，蛋白酶活性亦隨之增加，說明peat水解液對種曲蛋白酶活有一定程度上的刺激作用。

3.2.2 peat水解液對滬釀3.042成曲蛋白酶活影響

成曲蛋白酶活性大小，是醬油釀造中成曲質(zhì)量高低的一個(gè)重要指標(biāo)；同時(shí)成曲酶活也將直接影響后期發(fā)酵周期長短，醬油質(zhì)量的優(yōu)劣、原料中N源利用率高低等許多方面。

從表3可以看出此種成曲蛋白酶活性多在1-2×103單位之間。近種曲酶活性的一半；隨peat水解液含量的增加，成曲中蛋白酶活性有一定程度的增加，說明peat水解液對滬釀3.042成曲蛋白酶活有一定的促進(jìn)作用。

4 小結(jié)與思考

以上通過討論peat水解液對米曲霉滬釀3.042的影響，結(jié)果表明：尤其是生長速率和種曲、成曲蛋白酶活，其促進(jìn)作用在本實(shí)驗(yàn)中最高可達(dá)：生長速率+15.88%，種曲酶活可達(dá)+23.04%，成曲酶活可達(dá)+29.53%，由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得出以下結(jié)論：

①peat水解液對于滬釀3.042生長速率及種曲、成曲蛋白酶活則有較明顯的刺激作用，其中，peat水解液含量為30%的試驗(yàn)組所得結(jié)果最為明顯。

②考慮到peat水解液成份含量的不均一性及其制備工藝的繁瑣性，不易大規(guī)模生產(chǎn)，但實(shí)際生產(chǎn)過程中可以考慮把peat水解液作為生長因子添加到培養(yǎng)基質(zhì)中去，為醬油釀造新工藝的選擇與設(shè)計(jì)提供一點(diǎn)參考。

③由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，peat水解液對滬釀3.042蛋白酶活性有相當(dāng)?shù)拇碳ぷ饔?，由此可以得到點(diǎn)啟發(fā)：peat水解液在酶制品工藝方面可能有廣闊的應(yīng)用前景，這還須進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]Futhsman.c.m.peat：Industical chemistry and Technology， New York，Aoademic press.1980.18

[2]王怡平等.《中國食用菌》1995.2.37—40.

[3]肖亞中等.《生的學(xué)雜志》1996.4.18—110.

[4]Martin.A.M.Can.J.Microbilo 1990.29.108—110.

[5]上海市糧油工業(yè)公司、上海市釀造科學(xué)研究所、《發(fā)酵調(diào)味品生產(chǎn)技術(shù)》（上冊）1978；輕工業(yè)出版社（中冊）1979.

[6]江清彥等.《中國調(diào)味品》1990.11.6-9.