阻斷腹腔淋巴回流減輕重癥腹腔感染大鼠急性肺損傷

張淑坤，崔乃強(qiáng)，卓玉珍，傅 強(qiáng)，張艷敏

腸道有豐富的淋巴管和完整的淋巴引流系統(tǒng)，肺是首個(gè)接納腸道回流淋巴的器官，臨床和動物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，在重癥腹腔感染發(fā)生時(shí)，最先受損的腸外器官也是肺［1-2］，所以我們推測腹腔淋巴系統(tǒng)是重癥腹腔感染并發(fā)急性肺損傷（acute lung injury，ALI）時(shí)細(xì)菌和內(nèi)毒素移位的主要途徑。本研究采用人工胃液聯(lián)合大腸桿菌腹腔內(nèi)注射制備大鼠腹腔感染模型，之后行胸導(dǎo)管結(jié)扎和引流，旨在探討阻斷腹腔淋巴回流對腹腔感染大鼠肺損傷的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量（280±20）g，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所。

1.1.2 主要試劑 取10.5％鹽酸16.4mL，胃蛋白酶（sigma公司）10g，加生理鹽水至1000mL，配制成pH=1.5的人工胃液。大腸桿菌菌株來自臨床腹膜炎病人，經(jīng)全自動微生物分析系統(tǒng)（VITEK-AMS）鑒定為大腸桿菌（E.Coli）后接種、培養(yǎng)，配制成2×109cfu/mL的細(xì)菌懸濁液。MPO測定試劑盒和考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒為南京建成生物公司產(chǎn)品，TNF-α檢測試劑盒購自Cusabio公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制備和處理 40只健康雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)（SO）組、腹腔感染模型（IAI）組、胸導(dǎo)管結(jié)扎（TL）組和胸導(dǎo)管結(jié)扎加引流（TLD）組。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)前12h禁食，自由飲水。采用人工胃液聯(lián)合大腸桿菌腹腔內(nèi)注射制備大鼠腹腔感染模型［3］，SO組以等量10％BaSO4營養(yǎng)肉湯取代菌液注射。TL組于制模后2h以10％水合氯醛3mL/kg腹腔注射麻醉，備皮，消毒，腹正中切口進(jìn)腹后，將肝、胃推向上方，小腸和左腎翻向右側(cè)，于脊柱左側(cè)約1cm處打開后腹膜，找到位于腹主動脈左后方乳白色、半透明狀的胸導(dǎo)管腹段，于靠近膈肌處穿線結(jié)扎胸導(dǎo)管。TLD組在結(jié)扎胸導(dǎo)管后，在近端以彎成魚鉤狀的7號頭皮針引流淋巴液（圖1），生物膠固定后還納腹腔臟器，濕紗布覆蓋切口并保持濕潤狀態(tài)。持續(xù)引流4h，可獲得淋巴液約1.2mL。制模后6h各組大鼠分別行右主支氣管肺泡灌洗，留取BALF行細(xì)胞學(xué)分析。距回盲部5～10cm處取末端回腸5cm，和左下肺葉組織行蘇木精-伊紅染色觀察病理改變。繼續(xù)取5cm末端回腸和左肺上葉，應(yīng)用酶化學(xué)法檢測肺和回腸組織MPO活性。

圖1 大鼠胸導(dǎo)管引流

1.2.2 右主支氣管灌洗和BALF分析 處死大鼠，解剖游離出右主支氣管，T形切口，用尖端剪成楔形的塑膠管插入3cm并縫扎固定。用2mL生理鹽水行肺泡灌洗2次，滯留5min后緩慢吸出。將兩次BALF放入同一離心管中，1500r/min離心10min，回收上清，按試劑盒說明考馬斯亮蘭法檢測BALF中蛋白含量，ELISA檢測TNF-α含量。用1mL生理鹽水重懸細(xì)胞沉淀，取30μL重懸液涂片，進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。

1.2.3 肺和回腸組織MPO活性 按試劑盒說明化學(xué)比色法測定。

1.2.4 肺和回腸組織HE染色 末端回腸和左肺下葉用10％福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，5μm厚度連續(xù)切片，常規(guī)HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織和腸黏膜組織病理改變。

2 結(jié)果

2.1 肺和回腸組織病理學(xué)改變 光鏡下，SO組大鼠肺血管、肺泡間質(zhì)和肺泡上皮小葉間質(zhì)均正常。IAI組肺肺毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，肺泡壁間質(zhì)明顯增寬，可見斷裂、融合，大量炎細(xì)胞浸潤及廣泛實(shí)質(zhì)樣變。TL組和TLD組肺泡間質(zhì)破壞、炎細(xì)胞浸潤等病理損傷均有所減輕（圖2A）。SO組大鼠回腸絨毛結(jié)構(gòu)完整。IAI組和TL組大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞壞死，絨毛剝脫，變矮，固有膜層有大量炎細(xì)胞浸潤。TLD組炎細(xì)胞浸潤和絨毛脫落減少，黏膜厚度及絨毛高度均有改善（圖2B）。

圖2 各組大鼠肺（A）和回腸（B）組織病理學(xué)變化（HE染色，×200，a SO組、b IAI組、c TL組和d TLD組）

2.2 肺和回腸組織MPO水平 IAI組大鼠肺組織MPO活性較SO組升高（P＜0.05）；TL組和TLD組大鼠肺組織MPO活性較模型組均降低（P＜0.05）。SO組和TL組大鼠回腸組織MPO活性較假手術(shù)組升高（P＜0.05），TLD組大鼠肺組織MPO活性較IAI組降低（P＜0.05，見表1）。

2.3 BALF中性粒細(xì)胞百分率變化 IAI組BALF的中性粒細(xì)胞百分率高于SO組（P＜0.05），TL組和TLD組中性粒細(xì)胞百分率均較IAI組降低（P＜0.05，見表2）。

2.4 BALF蛋白和TNF-α含量變化 IAI組BALF蛋白和TNF-α含量均高于SO組（P＜0.05），TL組和TLD組蛋白和TNF-α含量均較IAI組降低（均P＜0.05，見表3）。

表1 各組大鼠肺和回腸組織MPO變化（±s，U/g）

表1 各組大鼠肺和回腸組織MPO變化（±s，U/g）

注：與SO組比較，aP＜0.05；與IAI組比較，bP＜0.05

組別SO組IAI組TD組TDL組肺0.71±0.14 1.24±0.35a 0.86±0.24b 0.91±0.21b回腸0.58±0.12 1.26±0.26a 1.41±0.42b 0.72±0.25b

表2 各組大鼠BALF白細(xì)胞比例變化（±s，％）

表2 各組大鼠BALF白細(xì)胞比例變化（±s，％）

注：與SO組比較，aP＜0.05；與IAI組比較，bP＜0.05

組別SO組IAI組TD組TDL組中性粒細(xì)胞3.20±1.32 8.93±2.89a 4.99±2.01b 5.22±1.54b巨噬細(xì)胞87.55±5.81 85.25±5.27 86.50±7.07 86.17±5.46淋巴細(xì)胞9.25±5.11 5.82±4.07 8.50±7.02 9.87±4.27

表3 各組大鼠BALF蛋白和TNF-α含量變化（±s）

表3 各組大鼠BALF蛋白和TNF-α含量變化（±s）

注：與SO組比較，aP＜0.05；與IAI組比較，bP＜0.05

組別SO組IAI組TD組TDL組蛋白（g/L）0.19±0.04 0.59±0.1a 0.26±0.08b 0.24±0.07b TNF-α（μg/g）3.20±1.19 4.71±1.22a 3.38±1.07b 3.58±0.99b

3 討論

祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肺與大腸通過經(jīng)脈聯(lián)系，一陰一陽表里相對，臟腑陰陽表里相合。肺的肅降決定著腸的通降傳導(dǎo)，同時(shí)腸的通降傳導(dǎo)又反過來影響著肺的肅降。臨床上根據(jù)這一理論，采用通里攻下法治療重癥腹腔感染取得良好療效［4］。盡管“肺與大腸表里”這一傳統(tǒng)理論經(jīng)受了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)臨床實(shí)踐的檢驗(yàn)和考驗(yàn)，但仍缺乏客觀證據(jù)闡明兩者的相互聯(lián)系途徑和作用機(jī)制?！案骨桓腥緦?dǎo)致肺損傷”在中醫(yī)理論屬于肺與大腸相表里的“腸病及肺”的范疇，明確腹腔感染導(dǎo)致肺損傷的途徑問題，將為“肺與大腸相表里”的臨床應(yīng)用提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

腹腔感染時(shí)，中性粒細(xì)胞在肺組織的粘附、聚集和激活，被認(rèn)為是造成組織損傷的第一步，同時(shí)也是引起炎癥瀑布效應(yīng)，造成其他重要器官損傷的機(jī)制之一［5］。MPO是中性粒細(xì)胞的標(biāo)志物。我們采用人工胃液聯(lián)合大腸桿菌腹腔內(nèi)注射法制備大鼠腹腔感染模型，檢測各組大鼠肺組織MPO活性、BALF的中性粒細(xì)胞百分比和蛋白含量，觀察肺組織病理變化，結(jié)果表明，胸導(dǎo)管結(jié)扎或引流均能能減輕肺組織中性粒細(xì)胞浸潤和病理損傷，減少BALF中蛋白漏出。這些結(jié)果提示，阻斷腹腔淋巴回流能減輕肺組織中性粒細(xì)胞集聚造成的病理損傷，淋巴途徑在腹腔感染早期并發(fā)ALI中起主要作用。

ALI的特征是由肺間質(zhì)急性炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的肺內(nèi)皮和上皮細(xì)胞屏障損傷，細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)作為重要的信號因子，在啟動、放大和延續(xù)局部和全身炎癥反應(yīng)中起重要作用，其中TNF-α是炎性反應(yīng)中釋放最早的內(nèi)源性前炎性因子［6-7］。在腹腔感染大鼠模型的BALF中，我們檢測到TNF-α含量較對照大鼠升高，而胸導(dǎo)管結(jié)扎或引流均能減少BALF中TNF-α含量，說明阻斷腹腔淋巴回流能減少肺組織炎性細(xì)胞因子TNF-α釋放，從而減輕或阻止肺臟和全身炎癥反應(yīng)。在本研究中，值得注意的是胸導(dǎo)管結(jié)扎在減輕肺組織中性粒細(xì)胞浸潤和病理損傷的同時(shí)，卻加重了回腸中性粒細(xì)胞浸潤和病理損傷，而胸導(dǎo)管結(jié)扎并引流能同時(shí)減輕肺和回腸組織中性粒細(xì)胞浸潤和病理損傷。這一結(jié)果提示，胸導(dǎo)管中的淋巴液具有組織損傷性，可能是導(dǎo)致器管功能障礙的來源［8］。

既往我們對腸源性內(nèi)毒索移位后在腹腔感染大鼠各臟器和體液中的分布進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)胸導(dǎo)管淋巴液中的內(nèi)毒素含量明顯高于門靜脈和股靜脈血中的內(nèi)毒素含量［9］。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在重癥腹腔感染早期所致肺損傷中起主要作用的是淋巴途徑，而非門靜脈途徑，同時(shí)也提示胸導(dǎo)管中的淋巴液可能是導(dǎo)致器管損傷的最初來源。

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