米良一號(hào)獼猴桃遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

田宏現(xiàn) ，苑 平 ，王曼玲 ，劉 藝 ，李 菁 ，夏新界 ，譚曉風(fēng)

米良一號(hào)獼猴桃遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

田宏現(xiàn)1，2，苑 平2，王曼玲3，劉 藝2，李 菁2，夏新界3，譚曉風(fēng)1

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.吉首大學(xué)，湖南 吉首 416000；3.中國(guó)科學(xué)院 亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

為建立獼猴桃基因功能研究技術(shù)平臺(tái)并通過(guò)生物技術(shù)改良獼猴桃, 選用米良一號(hào)葉片和莖為外植體,通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基, 建立了適合轉(zhuǎn)化的高效再生系統(tǒng),通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)將ACC（1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸）氧化酶基因成功轉(zhuǎn)化米良一號(hào),構(gòu)建了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)米良一號(hào)遺傳轉(zhuǎn)化體系。結(jié)果表明，TD培養(yǎng)基為合適的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基,誘導(dǎo)率達(dá)100%,愈傷經(jīng)3次繼代培養(yǎng)轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基,分化率為90%。共獲得29株潮霉素抗性植株,隨機(jī)挑選 14株經(jīng)PCR檢測(cè),其中10株檢測(cè)到ACC氧化酶基因目的條帶,陽(yáng)性植株占71.4%。

獼猴桃；根癌農(nóng)桿菌；轉(zhuǎn)化體系；組織培養(yǎng)

獼猴桃原產(chǎn)中國(guó)，是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高的水果，素有“果中之王”的美譽(yù)。它含有多種氨基酸，以及豐富的礦物質(zhì)、胡蘿卜素和多種維生素，對(duì)保持人體健康具有重要的作用。維生素C含量比柑桔高5至10倍，是各種水果中營(yíng)養(yǎng)成份最豐富、最全面的水果。也對(duì)多種疾病有著很好的預(yù)防和治療的作用。

米良一號(hào)獼猴桃是吉首大學(xué)石澤亮教授于20世紀(jì)80年代選育出來(lái)的美味獼猴桃優(yōu)良品種，它具有適應(yīng)性強(qiáng)、果大、結(jié)果早、產(chǎn)量高、含糖量高、含維生素C高、較耐貯等優(yōu)點(diǎn)。目前已推廣至15個(gè)省市，全國(guó)種植面積1.3萬(wàn)hm2。其中湘西自治州約0.5萬(wàn)hm2。獼猴桃生產(chǎn)已成了我國(guó)山區(qū)廣大農(nóng)民脫貧致富的重要途徑[1]。

ACC氧化酶是乙烯生物合成途徑的關(guān)鍵酶，它直接催化ACC(1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸)轉(zhuǎn)變?yōu)橐蚁?，通過(guò)調(diào)節(jié)它的表達(dá)能有效地調(diào)節(jié)乙烯的合成量，從而達(dá)到控制果實(shí)成熟時(shí)間的目的。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)獼猴桃各個(gè)品種組織培養(yǎng)的研究已經(jīng)很充分，但分子方面的研究還不是很多，目前未見(jiàn)關(guān)于米良一號(hào)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的報(bào)道[2-3]。以米良一號(hào)獼猴桃葉片和莖為外植體，誘導(dǎo)出愈傷。本文通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)、繼代、分化、生根培養(yǎng)基的研究建立了米良一號(hào)高效再生系統(tǒng)，并從共培養(yǎng)、篩選培養(yǎng)、預(yù)分化等步驟建立米良一號(hào)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系，為開(kāi)展米良一號(hào)基因組學(xué)研究和獲得耐貯、高抗性品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

受體植物材料：選取米良一號(hào)優(yōu)良單株上無(wú)病蟲(chóng)害的1年生硬枝和當(dāng)年生嫩枝及葉片為材料。

菌種和質(zhì)粒：根癌農(nóng)桿菌菌株為EHA105，質(zhì)粒為pCAMBIA1300-163，為中科院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所提供。該質(zhì)粒T-DNA區(qū)結(jié)構(gòu)如圖1，其中含有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpt)。

圖1 植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-163的T-DNA區(qū)Fig.1 Schematic representation of the T-DNA region of plasmid pCAMBIA1300-163

培養(yǎng)基：

誘導(dǎo)培養(yǎng)基TD：MS + 10 mg·L-16-BA + 0.2 mg·L-1NAA + 0.2 mg·L-1TDZ + 30 g·L-1蔗糖 +7.5 g·L-1瓊脂；

繼代培養(yǎng)基Y1:MS + 0.25 mg·L-16-BA + 1 mg·L-1NAA + 30 g·L-1蔗糖 + 7.5 g·L-1瓊脂；

共培養(yǎng)基YA：MS + 0.25 mg·L-16-BA + 1 mg·L-1NAA + 30 g·L-1蔗糖 + 0.1 mmol乙酰丁香酮+ 7.5 g·L-1瓊脂，pH 5.6；

篩選培養(yǎng)基YS:MS + 0.25 mg·L-16-BA + 1 mg·L-1NAA+500 mg·L-1頭胞霉素+400 mg·L-1羧芐青霉素+ 20 mg·L-1潮霉素+ 30 g·L-1蔗糖+ 7.5 g·L-1瓊脂，pH 6.0；

預(yù)分化培養(yǎng)基ZD3:MS+3.0 mg·L-1ZT+0.5 mg·L-16-BA + 0.05 mg·L-1NAA +30 g·L-1蔗糖+ 400 mg·L-1羧芐青霉素+7.5 g·L-1瓊脂，pH 6.0；

分化培養(yǎng)基ZD：MS+1.0 mg·L-1ZT+30 g·L-1蔗糖+ 400 mg·L-1羧芐青霉素+ 7.5 g·L-1瓊脂，pH 6.0；

生根培養(yǎng)基YR:1/2MS + 0.7 mg·L-1IBA +0.15 mg·L-16-BA + 15 g·L-1蔗糖+ 7.5 g·L-1瓊脂，pH 6.0。

1.2 組織培養(yǎng)

1.2.1 獼猴桃愈傷組織的誘導(dǎo)

挑選供試材料有芽莖段先用洗衣粉洗滌，隨后盛于塑料桶中用自來(lái)水流水沖洗48 h。接種時(shí)先用75%的乙醇表面消毒30 s，無(wú)菌水沖洗2～3次，再用0.1%升汞溶液消毒8～10 min，無(wú)菌水沖洗5～6次。將滅菌枝條切成0.6～0.8 cm長(zhǎng)的莖段外植體，于滅菌濾紙上晾干，然后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每瓶2節(jié)外植體，25 ℃～26 ℃，14 h光照培養(yǎng)，光強(qiáng)1000～1500 lx[1]。

取獼猴桃無(wú)菌苗葉片，切成0.5 cm × 0.5 cm大小的葉盤(pán)，葉片正面向上于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上避光培養(yǎng)，7 d左右可以看到葉脈及葉片邊緣處開(kāi)始膨大，愈傷開(kāi)始生長(zhǎng)。

1.2.2 愈傷組織繼代

接種外植體30 d后轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基繼代，每20 d繼代1次，連續(xù)繼代3次，觀察愈傷狀態(tài)。

1.2.3 愈傷組織分化

挑選繼代3次的愈傷轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，20 d后統(tǒng)計(jì)分化率(分化率=能分化出植株的愈傷數(shù)/接入愈傷總數(shù)×100%)。

1.3 反義表達(dá)載體的構(gòu)建

從獼猴桃中克隆得到ACC氧化酶基因的cDNA片段，測(cè)序確定為所需片段后將其反向連入表達(dá)載體pCAMBIA1300 + 163當(dāng)中，得到獼猴桃ACC氧化酶基因的反義表達(dá)載體。

1.4 遺傳轉(zhuǎn)化

1.4.1 農(nóng)桿菌與愈傷組織的共培養(yǎng)

EHA105(含pCOsAc1300 + 163質(zhì)粒)劃LB板(加 Kan 50 mg·L-1和 CHL 34 mg·L-1)，28 ℃培養(yǎng)2 d后挑單菌落，在LB板(加Kan 50 mg·L-1和CHL 34 mg·L-1)劃線至全培養(yǎng)皿，28 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，用液體共培養(yǎng)基將菌洗下，調(diào)OD600=0.6挑選表面干爽結(jié)構(gòu)致密的愈傷組織浸入上述準(zhǔn)備好的菌液中，浸泡30 min，每隔5 min搖一次。用滅菌濾紙吸干表面多余菌液。將愈傷轉(zhuǎn)移到固體共培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基表面鋪一層用液體共培養(yǎng)基浸濕的滅菌濾紙，25 ℃～26 ℃下暗培養(yǎng)3～4 d[4]。

1.4.2 抗性愈傷組織的篩選

3 d后，將共培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)入滅菌三角瓶，滅菌水沖洗5～6次至液體不渾濁，再用加有500 mg·L-1頭胞霉素和400 mg·L-1羧變青霉素的滅菌水浸泡30 min，每隔5 min搖一次。用滅菌濾紙吸干水分，轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基YS中，25 ℃～26 ℃暗培養(yǎng)，20 d后將抗性愈傷轉(zhuǎn)入新的篩選培養(yǎng)基。

1.4.3 抗性愈傷組織的分化

兩次篩選后，將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基ZD3，置于25 ℃～26 ℃，每天14 h光照培養(yǎng)，光強(qiáng)1000～1500 lx，每20 d更換一次新培養(yǎng)基。當(dāng)愈傷開(kāi)始變成紅褐色并開(kāi)始分化出芽時(shí)將愈傷轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基ZD上。

1.4.4 抗性植株的生根

綠苗長(zhǎng)至約3～5 cm，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基YR，置光照培養(yǎng)箱中，條件同預(yù)分化。

1.4.5 抗性植株的練苗

挑根多而粗壯的抗性植株，擰松瓶蓋于室內(nèi)煉苗3d后用自來(lái)水將幼苗上的培養(yǎng)基沖洗干凈，移栽到裝有泥土（基質(zhì)土∶珍珠巖=3∶1）的盆子，置于置物箱中室內(nèi)練苗2周后打開(kāi)置物箱室內(nèi)練苗3 d，移至室外1周左右即可移入實(shí)驗(yàn)田中。

1.5 抗性植株的PCR檢測(cè)

DNA提?。喝】剐垣J猴桃植株幼嫩葉片0.2～1.0 g，采用CTAB區(qū)室法提取基因組DNA。

PCR擴(kuò)增:擴(kuò)增產(chǎn)物為575 bp的基因片段。

上 游 引 物 為 Term F：5′ -GGT，GCT，TTC，CCA，GTC，CAA，ATC，GTT-3′。

下 游 引 物 為 Term R：5′ -CCA，GGT，TTA，GTC，GTC，TCG，TGT，CTG，GT-3′。

PCR擴(kuò)增體系(20 μL)：Takara公司TaqDNA聚 合 酶 (5 mmol·μL-1)0.2 μL，10×Buffer (KCl)緩 沖 液 2.0 μL，MgCl21.6 μL，dNTP Mixture 2.0 μL，Term F(20 mmol·μL-1)0.4 μL，Term R(20 mmol·μL-1)0.4 μL，模板 1 μL，ddH2O 12.4 μL。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃變性5 min后運(yùn)行下循環(huán)，94 ℃ 35 s，59 ℃ 35 s，72 ℃ 45s，共 35 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃ 10 min。取PCR產(chǎn)物10 μL進(jìn)行常規(guī)瓊脂糖(1.0%)凝膠電泳分離并照相保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)獼猴桃愈傷誘導(dǎo)率的影響

莖段愈傷的誘導(dǎo)可選用Y1或者ZD為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，愈傷誘導(dǎo)所需時(shí)間比葉片要長(zhǎng)，主要是沿切口處開(kāi)始生長(zhǎng)。莖段愈傷結(jié)構(gòu)致密，顏色較深，分化出芽的效率相對(duì)較低，而且米良一號(hào)內(nèi)生菌比較多，用莖段誘導(dǎo)愈傷染菌率較高。

葉片誘導(dǎo)培養(yǎng)基選用TD，葉片接到培養(yǎng)基后，7天左右可以看到葉脈及葉片邊緣處開(kāi)始膨大，愈傷開(kāi)始生長(zhǎng)，除去壞死的葉片，獼猴桃葉片愈傷誘導(dǎo)率為100%（圖2-A），且在TDZ的培養(yǎng)基上即可直接分化出芽。

圖2 米良一號(hào)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系Fig.2 Genetic transformation of Miliang-1 by Agrobacterium-mediated method

2.2 繼代培養(yǎng)基對(duì)獼猴桃愈傷組織的影響

繼代培養(yǎng)基選用Y1，愈傷組織在此培養(yǎng)基都能很好的生長(zhǎng)，20 d左右繼代一次。愈傷組織在此培養(yǎng)基上繼代后，結(jié)構(gòu)致密，顏色翠綠，基本上不會(huì)出現(xiàn)褐化，但當(dāng)繼代時(shí)間超過(guò)30 d時(shí)，愈傷結(jié)構(gòu)開(kāi)始變的疏松，顏色變白，后期分化效率變低?？赡苁桥囵B(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)基本上消耗完畢而有害物質(zhì)積累過(guò)多造成的，所以20 d左右必須繼代一次，繼代次數(shù)超過(guò)3次后，愈傷狀態(tài)仍然保持很好的活力，基本上沒(méi)有出現(xiàn)愈傷褐化的現(xiàn)象（圖2-B）。

2.3 篩選時(shí)潮霉素濃度對(duì)米良一號(hào)愈傷生長(zhǎng)的影響

以Y1為培養(yǎng)基，在其中添加潮霉素用于篩選抗性愈傷，添加頭孢霉素和羧變霉素用于抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，將潮霉素濃度設(shè)為5個(gè)梯度，每個(gè)梯度10個(gè)皿，每個(gè)皿9個(gè)愈傷，即每個(gè)梯度90個(gè)愈傷，19 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示。當(dāng)潮霉素濃度達(dá)到40 mg·L-1時(shí)愈傷的存活率只有10%，當(dāng)濃度為50 mg·L-1時(shí)愈傷全部死亡，而將潮霉素濃度降低到20 mg·L-1時(shí)愈傷的存活率為43.3%，最終在繼代培養(yǎng)基中添加20 mg·L-1的潮霉素用于抗性愈傷的篩選（圖2-C）。

表1 潮霉素對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的影響Table 1 The effect of hygromycin on callus tissue growth

2.4 抗性愈傷的分化

將抗性愈傷接到預(yù)分化的培養(yǎng)基ZD3上，在此培養(yǎng)基中將ZT的濃度提至3.0 mg·L-1加速芽的誘導(dǎo)?？剐杂鷤麆傞_(kāi)始時(shí)為白色，在預(yù)分化的過(guò)程中逐漸變成綠色，當(dāng)愈傷開(kāi)始變成紅褐色時(shí)，開(kāi)始分化出芽（圖2-D）。此時(shí)再將愈傷接到分化培養(yǎng)基ZD上，此培養(yǎng)基降低ZT的濃度至1.0 mg·L-1，不影響芽的分化和生長(zhǎng)[5-7]。因?yàn)橛醒芯孔C明在植物體內(nèi)積累過(guò)高的ZT將影響后期根的分化[8]。

2.5 生根培養(yǎng)基對(duì)獼猴桃抗性植株生根的影響

在實(shí)驗(yàn)中，將IBA和6-BA，分別設(shè)成不同的濃度，米良一號(hào)在5種培養(yǎng)基中均能誘導(dǎo)出根。當(dāng)IBA的濃度達(dá)到1 mg·L-1時(shí)，由于生長(zhǎng)素濃度過(guò)高，芽的底部很容易誘導(dǎo)出愈傷，而且愈傷的生長(zhǎng)速度很快，雖然也能長(zhǎng)出根來(lái)，但由于愈傷過(guò)大，根的生長(zhǎng)受到嚴(yán)重的抑制，上面的芽的活力也比較低，生長(zhǎng)的很慢，甚至還會(huì)出現(xiàn)落葉的現(xiàn)象。當(dāng)在其中添加一定濃度的6-BA時(shí)，芽的生長(zhǎng)狀況明顯比沒(méi)加時(shí)要好，但卻對(duì)根的生根沒(méi)有任何促進(jìn)作用。當(dāng)降低IBA的濃度后，愈傷的生根變慢，但還是有一小塊愈傷被誘導(dǎo)出來(lái)，根的誘導(dǎo)率有明顯的提高。隨著IBA濃度的降低，平均每個(gè)芽誘導(dǎo)出來(lái)根的數(shù)目和根的生長(zhǎng)速度也相應(yīng)降低[9-11]。因此最終我們選擇1/2 MS + 0.7 mg·L-1IBA + 0.15 mg·L-16-BA為米良一號(hào)的生根培養(yǎng)基。將長(zhǎng)至3 cm左右的芽接到Y(jié)R培養(yǎng)基上，20 d左右即可成功誘導(dǎo)出根，米良一號(hào)根的誘導(dǎo)比較容易，且根比較粗狀，但生根的數(shù)量不多，平均每個(gè)芽10條根左右（圖2-E）。

表2 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)不定芽生根的影響Table 2 The effects of betanaphthoxy acetic acid on rooting

2.6 練 苗

獼猴桃的葉片較大，水份的蒸發(fā)量較高，如果直接將組培得到的再生苗種在自然環(huán)境中會(huì)因?yàn)槭婊盥什桓?。本?shí)驗(yàn)中將米良一號(hào)再生苗開(kāi)蓋3 d后，種在小花盆中，先將其放在有蓋且透光性較好的置物箱中，以防水份蒸發(fā)過(guò)快。等其恢復(fù)生長(zhǎng)后再逐步將其釋放到環(huán)境中去，存活率可達(dá)到90%以上（圖2-F）。

2.7 抗性植株的PCR檢測(cè)

經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化獲得29株潮霉素抗性植株，隨機(jī)選取其中14株提取基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果其中有10株擴(kuò)出目的條帶，為陽(yáng)性植株，陽(yáng)性植株率為71%，如圖3為14株抗性植株ACC氧化酶基因的PCR檢測(cè)結(jié)果，575 bp大小為目的條帶，結(jié)果顯示抗性植株中10株的擴(kuò)增片段大小與陽(yáng)性對(duì)照的條帶一致，而陰性對(duì)照(水和非轉(zhuǎn)基因米良一號(hào)植株)沒(méi)有目的條帶，證明目的基因已整合到轉(zhuǎn)化米良一號(hào)的基因組中。

圖3 轉(zhuǎn)化植株的PCR分析Fig.3 PCR analysis of transformed plants

泳道1為D2000 ladder marker；泳道2為無(wú)模板陰性對(duì)照；泳道3為未轉(zhuǎn)化米良一號(hào)的DNA PCR擴(kuò)增陰性對(duì)照；泳道4為質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照；泳道5～18為待檢測(cè)的樣品DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(目標(biāo)片斷的大小為575 bp)。

3 結(jié)論與討論

農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法是一個(gè)細(xì)菌和愈傷組織共同作用的復(fù)雜過(guò)程。凡是涉及到細(xì)菌活性或愈傷組織狀態(tài)的因素都可能影響轉(zhuǎn)化效果。對(duì)米良一號(hào)而言，一方面是愈傷分化較難，另一面是潮霉素篩選時(shí)對(duì)愈傷組織造成傷害，潮霉素濃度過(guò)高時(shí)愈傷完全不能生長(zhǎng)。篩選時(shí)培養(yǎng)基中合適的潮霉?jié)舛仁呛Y選成功的關(guān)鍵所在。目前仍未見(jiàn)農(nóng)桿菌介導(dǎo)米良一號(hào)轉(zhuǎn)化的報(bào)道。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的研究，找到合適的誘導(dǎo)、繼代、分化培養(yǎng)基并優(yōu)化了生根條件，為農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因獼猴桃提供合適的組培體系。另一方面，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)潮霉素濃度的摸索，找到了一個(gè)適合用于米良一號(hào)篩選的潮霉素濃度，并對(duì)侵染時(shí)農(nóng)桿菌的濃度，愈傷的處理以及共培養(yǎng)的條件等進(jìn)行了優(yōu)化且取得了較為理想的效果。本實(shí)驗(yàn)以葉片和莖為外植體，首次采用農(nóng)桿菌法成功轉(zhuǎn)化米良一號(hào)，為通過(guò)轉(zhuǎn)基因研究來(lái)改良米良一號(hào)奠定了基礎(chǔ)。

米良一號(hào)獼猴桃屬于多糖多酚類(lèi)植物，多糖物質(zhì)主要存在于葉中，葉片越老多糖含量越高，在DNA提取過(guò)程中，這些物質(zhì)容易與DNA不可逆地粘附在一起而污染DNA，從而抑制DNA限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、TaqDNA聚合酶等多種分了生物學(xué)酶類(lèi)的活性[10]，傳統(tǒng)的CTAB法、SDS法等都很難達(dá)到要求[12-14]，本實(shí)驗(yàn)中我們采用CTAB區(qū)室法提取米良一號(hào)獼猴桃葉片中的基因組DNA，并對(duì)其進(jìn)行一定改進(jìn)使所得到的基因組DNA能夠滿足PCR鑒定和Southern印跡雜交要求。

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Establishment of transformation system of Kiwifruit Miliang-1

TIAN Hong-xian1,2, YUAN Ping2, WANG Man-ling3, LIU Yi2, LI Jing2, XIA Xin-jie3, TAN Xiao-feng1
(1. Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China; 2. Jishou University, Jishou 416000, Hunan,China; 3. Institute of Subtropical Agriculture eology, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, Hunan, China)

In order to establish the technology platform for function analysis of genes and genetic improvement of kiwifruit through biotechnology, the leaves and stems of Miliang-1 plants were used as explants. An efficient regeneration system was established for gene transformation by optimizing the culture medium. By using Agrobacterium-mediated method, transgenic plants containing the ACO(1-Aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase) gene fragment were successfully obtained. The results show that the TD medium was the efficent medium for callus induction with a rate of 100%. After three times of subcultures, calli were moved into the differentiation medium, and the rate of differentiation was 90%. A total of 29 hygromycin resistant plants were obtained, and 14 of them were chosen randomly for PCR analysis. Ten of the analyzed plants were shown to be positive for the ACO gene insert (71.4 % ).

Actinidia deliciosa (A. Cher.) (kiwifruit)；Agrobacterium tumefaciens；transformation system；tissue culture

S663.4

A

1673-923X(2012)08-0081-05

2012-01-24

湖南省省級(jí)科技計(jì)劃(專(zhuān)項(xiàng)計(jì)劃）項(xiàng)目“耐貯保鮮高抗性轉(zhuǎn)基因獼猴桃的研究和開(kāi)發(fā)”（2008JT3008)；湖南省高校產(chǎn)學(xué)研合作示范基地開(kāi)放項(xiàng)目（2011jsjk003）

田宏現(xiàn)（1953—），男，湖南保靖人，教授，碩士生導(dǎo)師，博士生，主要從事微生物學(xué)和林業(yè)生物技術(shù)方面的研究。E-mail：jstianhx@163.com

譚曉風(fēng)（1956—），男，湖南茶陵人，教授，博士生導(dǎo)師，博士，主要從事經(jīng)濟(jì)林和林業(yè)生物技術(shù)研究；E-mail：tanxiaofengcn@126.com.cn；夏新界（1959-），男，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)樽魑锬湍娣肿由飳W(xué)；E-mail：jxxia@isa.ac.cn

[本文編校：吳 彬]