莪術(shù)油配伍椒目仁油對(duì)小鼠移植性腫瘤的抑制作用

謝艷華，賀中民，楊 倩，繆 珊，畢琳琳，孫紀(jì)元，王四旺

莪術(shù)油配伍椒目仁油對(duì)小鼠移植性腫瘤的抑制作用

謝艷華，賀中民，楊 倩，繆 珊，畢琳琳，孫紀(jì)元，王四旺

目的 觀察不同劑量莪術(shù)油配伍椒目仁油對(duì)小鼠移植性腫瘤S180的抑瘤作用，以及對(duì)人源性肝癌細(xì)胞株HepG2和大腸癌細(xì)胞株SW480的體外抑瘤作用。方法 72只二級(jí)昆明小鼠采用腫瘤移植法建立小鼠荷瘤動(dòng)物模型;椒莪軟膠囊灌胃給藥，劑量分別為0.3、0.6、1.2 ml/kg;氟尿嘧啶22.5 mg/kg作為陽(yáng)性對(duì)照藥腹腔注射給藥;連續(xù)給藥15 d，觀察藥物對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。對(duì)人源性肝癌細(xì)胞株HepG2和大腸癌細(xì)胞株 SW480 進(jìn)行傳代培養(yǎng)后，制備不同劑量(椒莪軟膠囊0． 015625、0． 03125、0． 0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/ml)含藥血清、氟尿嘧啶陽(yáng)性藥血清和腫瘤移植模型不用藥對(duì)照血清，作用于人源性肝癌細(xì)胞株HepG2和大腸癌細(xì)胞株SW480，四甲基偶氮唑藍(lán)比色法觀察血清對(duì)兩種細(xì)胞的抑制作用。椒莪軟膠囊0.0、6.25、12.5、25.0 μg/ml給藥15 h后，經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定對(duì)人源性肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果 ①椒莪軟膠囊0.3、0.6、1.2 ml/kg腫瘤抑制率分別為19.73%、32.22%和46.68%。隨著給藥劑量的增加，壞死的腫瘤細(xì)胞所占比例也相應(yīng)增加，生長(zhǎng)活躍的腫瘤細(xì)胞逐漸減少。②抑制作用隨劑量升高而作用增強(qiáng)，對(duì)人源性肝癌細(xì)胞株HepG2體外最低藥物物濃度為0. 0625 mg/ml，對(duì)大腸癌細(xì)胞株SW480體外最低藥物濃度為0.125 mg/ml。③椒莪軟膠囊可明顯促進(jìn)人源性肝癌細(xì)胞株HepG2的細(xì)胞凋亡。結(jié)論 椒莪軟膠囊對(duì)小鼠移植性腫瘤有明顯的抑制作用，對(duì)人源性肝癌細(xì)胞株HepG2和大腸癌細(xì)胞株SW480有明顯的抑制作用。椒莪軟膠囊在臨床具有廣闊的應(yīng)用前景。

椒莪軟膠囊;抗腫瘤;人肝癌HepG2細(xì)胞;人大腸癌SW480細(xì)胞;細(xì)胞凋亡

椒莪軟膠囊的主要成分為莪術(shù)油和椒目仁油組成。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，這兩種藥油中都含有一定的抗腫瘤活性成分，如莪術(shù)油中含有β-欖香烯，而椒目仁油中則含有α-亞麻酸等，作為中藥制劑用來(lái)治療腫瘤可能具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。如果對(duì)給藥劑型及給藥劑量進(jìn)行深層次研究或優(yōu)化配方，以降低其不良反應(yīng)，進(jìn)一步增強(qiáng)抗腫瘤作用，可能使椒莪軟膠囊具有更加可靠的臨床應(yīng)用價(jià)值。為進(jìn)一步闡明其藥效作用，觀察不同劑量莪術(shù)油配伍椒目仁油對(duì)小鼠移植性腫瘤S180的抑瘤作用，以及對(duì)人源性肝癌細(xì)胞株HepG2和大腸癌細(xì)胞株SW480的體外抑瘤作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品 椒莪軟膠囊內(nèi)容物，由第四軍醫(yī)大學(xué)藥物研究所制劑室提供，批號(hào)20111206;臨用前用色拉油配成不同濃度備用。

1.1.2 陽(yáng)性對(duì)照藥 氟尿嘧啶注射液(規(guī)格:0.25 g/10 ml)，上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號(hào):201108031，批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H31020593。

1.1.3 試劑 吐溫80購(gòu)自天津市化學(xué)試劑廠三分廠;液體RPMI-1640購(gòu)自Gibco公司;小牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程公司;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購(gòu)自Sigma公司;四甲基偶氮唑藍(lán)［3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT］購(gòu)自Sigma公司;磷酸緩沖液(phosphoric acid buffer，PBS)為實(shí)驗(yàn)室自配;96孔培養(yǎng)板購(gòu)自Costa公司;0.22 μm針式濾器購(gòu)自Pall公司。1.1.4 儀器 獨(dú)立通氣籠具(individually ventilated cages，IVC)飼養(yǎng)系統(tǒng)(上海紹豐實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司);德國(guó)Sartorius電子天平(感量0.1 mg);德國(guó)Axioskop 40蔡司顯微鏡(Carl Zeiss Far East Co．Ltd);DT-2000型電子天平(常熟市衡器廠);BIO-RAD Model 680全自動(dòng)酶標(biāo)儀，Gibco公司;ELITE ESP型流式細(xì)胞儀，Beckman-Coulter公司。

1.1.5 動(dòng)物 二級(jí)昆明小鼠72只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，6～8周齡，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)合格證號(hào):scxk(軍)字第2007-007號(hào)。1.1.6 瘤株 鼠源性小鼠荷瘤S180，人源性肝癌細(xì)胞株HepG2和大腸癌細(xì)胞株SW480，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 造模方法 二級(jí)昆明種小鼠72只，雄雌各半，體質(zhì)量18～22 g，6～8周齡。取荷S180瘤株的小鼠腹水制成瘤細(xì)胞混懸液，細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/ml。除正常組12只小鼠，其余60只用0.25 ml注射器吸取瘤細(xì)胞混懸液0.2 ml于小鼠腘窩皮下注射［1-2］。

1.2.1.2 動(dòng)物分組及給藥 將60只接種小鼠隨機(jī)分為5組，每組12只，雌雄各半，分別為:模型組，陽(yáng)性組(22.5 mg/kg，氟尿嘧啶)，椒莪軟膠囊小劑量組(0.3 ml/kg)、中劑量組(0.6 ml/kg)、大劑量組(1.2 ml/kg)。給藥組在造模當(dāng)天分別灌胃上述藥物，正常組及模型組灌胃等容量色拉油，每日1次。

在給藥2周后，完整取出小鼠腫瘤，脾和胸腺組織，并用電子天平(感量0.1 mg)即時(shí)稱重，計(jì)算瘤重，腫瘤抑制率和胸腺/脾臟指數(shù)。抑制率(%)=(模型組平均瘤質(zhì)量一給藥組平均瘤質(zhì)量)/模型組平均瘤質(zhì)量×100%。胸腺(脾臟)指數(shù)=［胸腺(脾臟)質(zhì)量/體質(zhì)量］×100。同時(shí)取小鼠部分腫瘤組織，固定于10%福爾馬林液中，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，蘇本素和伊紅染色(hematoxylin and eosin，HE)，DPX封片后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.2.2 體外抑瘤實(shí)驗(yàn)(MTT法)

1.2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出保存HepG2和SW480細(xì)胞的凍存管，迅速放入37℃恒溫水浴箱中，不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化。取出凍存管，用吸管吸取細(xì)胞懸液，注入離心管并滴加10倍體積含10%新生牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)基(含有雙抗)，混合后低速離心 1000 r/min，去除上清液，再重復(fù)用培養(yǎng)液清洗1次。用培養(yǎng)基適當(dāng)釋稀后，接種于75 ml玻璃培養(yǎng)瓶中，放在37℃，50 ml/L CO2孵箱靜置培養(yǎng)，24 h后更換液體，以后2～3 d更換1次培養(yǎng)液，長(zhǎng)滿80%后離心10 min× 1000 r/min后棄去上清液加入10倍體積含10%新生牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)基(含有雙抗)后按1∶2～1∶6傳代，于細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)［3-6］。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要時(shí)間終止細(xì)胞培養(yǎng)，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液20 μl(5 mg/ml)，37℃孵育4 h，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入DMSO 150 μl，振蕩10 min，使紫色結(jié)晶物充分溶解。全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)每組的吸光度A490值。

1.2.2.2 細(xì)胞接種及藥物處理 椒莪軟膠囊為0． 015625、0． 03125、0． 0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/ml等劑量組，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性組為加入22.5 mg/kg氟尿嘧啶、對(duì)照組(不加抗癌藥)和基質(zhì)組(只加培養(yǎng)液)，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。各組繼續(xù)培養(yǎng)至加藥后15 h。低速離心 1000 r/min后棄去上清液

用培養(yǎng)液吹打成單細(xì)胞懸液，培養(yǎng)細(xì)胞，1×106個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板，37℃、50 ml/L CO2孵箱培養(yǎng)12 h，細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)分組加入使其含不同濃度藥物。根據(jù)8孔吸光度值A(chǔ)490的光密度(optical density，OD)值計(jì)算腫瘤細(xì)胞抑制率(inhibition ratio，IR)，計(jì)算公式:IR=1－(用藥組平均OD值－基質(zhì)組平均OD值)/(對(duì)照組平均OD值－基質(zhì)組平均OD值)×100%。IR標(biāo)準(zhǔn)采用1978年全國(guó)抗癌藥物會(huì)議制定的《抗腫瘤藥物通用指標(biāo)》:IR＜30%為不敏感，歸陰性;IR≥30%為敏感，歸陽(yáng)性。

1.2.2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 根據(jù) MTT結(jié)果，將HepG2細(xì)胞用培養(yǎng)基適當(dāng)釋稀后，接種于75 ml玻璃培養(yǎng)瓶中，放在37℃，50 ml/L CO2孵箱靜置培養(yǎng)，24 h后更換液體，以后2～3 d更換1次培養(yǎng)液，長(zhǎng)滿80%后離心10 min× 1000 r/min后棄去上清液加入10倍體積含10%新生牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)基(含有雙抗)后按 1∶2～1∶6傳代，于細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。椒莪軟膠囊0.0、6.25、12.5、25.0 μg/ml共4組，加藥15 h;對(duì)照組不加抗腫瘤藥。①收集細(xì)胞:收集細(xì)胞到10 ml的離心管中，1000 r/min離心5 min，每樣本細(xì)胞數(shù)為1×106，棄去培養(yǎng)液;②用孵育緩沖液洗1次，1000 r/min離心5 min;③用100 μl的標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育10～15 min;④ 1000 r/min離心5 min沉淀細(xì)胞，孵育緩沖液洗1次;⑤重復(fù)步驟③、④2次;⑥將細(xì)胞重懸于200 μl Binding Buffer(連接緩沖液);⑦加入10 μl Annexin V-FITC(細(xì)胞凋亡雙染標(biāo)記物)和5 μl PI(碘化吡啶核酸染料)，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min或4℃反應(yīng)30 min;⑧加入300 μl Binding Buffer，在1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行雙參數(shù)分析，將凋亡細(xì)胞(Annexin V+)與繼發(fā)性壞死細(xì)胞(Annexin V+/PI+)區(qū)分開，計(jì)算凋亡細(xì)胞的百分率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 給藥各組的瘤重、腫瘤抑制率和胸腺/脾臟指數(shù) 陽(yáng)性組與小、中、大劑量組的瘤重分別為(0.78±0.31)g與(1.22±0.29)、(1.03±0.25)、(0.81±0.28)g，其腫瘤抑制率分別達(dá)48.71%、19.73%、32.22%、46.68%，陽(yáng)性藥物和椒莪軟膠囊大劑量對(duì)小鼠S180荷瘤的抑制與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，中劑量和小劑量與對(duì)照組比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.05)。陽(yáng)性組、大劑量組小鼠的胸腺/脾臟指數(shù)與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，中、小劑量組小鼠的胸腺指數(shù)/脾臟差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。

2.2 不同劑量對(duì)小鼠腫瘤細(xì)胞病理形態(tài)的影響

對(duì)各組瘤塊進(jìn)行常規(guī)病理學(xué)檢查顯示:模型組為典型多形性細(xì)胞型橫紋肌肉瘤;陽(yáng)性組為成熟橫紋肌，肌間見大量炎癥細(xì)胞，周圍為90%的腫瘤性壞死組織，在壞死組織中可見小量散在橫紋肌肉瘤細(xì)胞;小劑量組70%～80%腫瘤細(xì)胞活躍生長(zhǎng)，20%左右為腫瘤性壞死伴急性炎癥;中劑量組40%～50%腫瘤細(xì)胞活躍生長(zhǎng)，50%左右為腫瘤性壞死伴急性炎癥;大劑量組20%～30%腫瘤細(xì)胞活躍生長(zhǎng)，80%左右為腫瘤性壞死伴急性炎癥。隨著給藥劑量的增加，壞死的腫瘤細(xì)胞所占比例也相應(yīng)增加，生長(zhǎng)活躍的腫瘤細(xì)胞逐漸減少(圖1～5)。

圖1 模型組(HE×100)

圖2 陽(yáng)性組(HE×100)

圖3 小劑量組(HE×100)

圖4 中劑量組(HE×100)

圖5 大劑量組(HE×100)

表1 不同濃度椒莪軟膠囊對(duì)小鼠S180瘤株的影響(n=12，ˉx±s)

2.3 體外抑瘤結(jié)果 人源性肝癌細(xì)胞株HepG2和大腸癌細(xì)胞株SW480對(duì)椒莪軟膠囊敏感，椒莪軟膠囊在0.125～4 mg/ml濃度范圍內(nèi)細(xì)胞有明顯的抑制作用，抑制作用隨劑量升高而作用增強(qiáng)。對(duì)人源性肝癌細(xì)胞株HepG2體外最低抑瘤濃度為0. 0625 mg/ml，濃度低于0. 0625 mg/ml幾乎無(wú)抑瘤作用;對(duì)大腸癌細(xì)胞株SW480細(xì)胞體外最低抑瘤濃度為0.125 mg/ml，濃度低于0.125 mg/ml幾乎無(wú)抑瘤作用(表2)。

表2 不同濃度椒莪軟膠囊作用HepG2和SW480細(xì)胞15 h后MTT法檢測(cè)結(jié)果(n=8，ˉx±s，IR，%)

2.4 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡及凋亡后死亡數(shù)量隨著給藥劑量的增加而增加。不同濃度的椒莪軟膠囊(0.0、6.25、12.5、25.0 μg/ml)作用下，人源性肝癌細(xì)胞株HepG2凋亡細(xì)胞所占比例分別為3.5%、5.6%、12.3%和26.9%，死亡細(xì)胞所占比例分別為1.8%、1.8%、7.7%和13.2%(圖6 ～9)。

圖9 大劑量組

3 討論

在體內(nèi)椒莪軟膠囊對(duì)小鼠移植性腫瘤S180的生長(zhǎng)有顯著抑制作用，陽(yáng)性組與小、中、大劑量組的瘤重分別為(0.78±0.31)g與(1.22±0.29)、(1.03±0.25)、(0.81 ±0.28)g，其腫瘤抑制率分別達(dá)48.71%、19.73%、32.22%、46.68%，與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，同劑量呈正相關(guān);病理圖片所示與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相符，隨著給藥劑量的增加，壞死的腫瘤細(xì)胞所占比例也相應(yīng)增加，生長(zhǎng)活躍的腫瘤細(xì)胞逐漸減少，給藥劑量與活躍腫瘤細(xì)胞成反比例關(guān)系，陽(yáng)性藥、椒莪軟膠囊中、大劑量組作用效果十分明顯。同時(shí)，各劑量組小鼠的體質(zhì)量沒有明顯的下降，說(shuō)明在給藥劑量范圍內(nèi)椒莪軟膠囊還未能抑制荷瘤小鼠體質(zhì)量降低。由于周期較短，僅為15 d，故未能觀察小鼠生存時(shí)間。

抑制作用隨劑量升高而作用增強(qiáng)，對(duì)人源性肝癌細(xì)胞株HepG2，體外最低藥物物濃度為0. 0625 ng/ml;對(duì)大腸癌細(xì)胞株SW480，體外最低藥物濃度為0.125 mg/ml。椒莪軟膠囊抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)效應(yīng)與其濃度呈線性關(guān)系，只有保持一定的血藥濃度，才能更好地發(fā)揮抗瘤作用。椒莪軟膠囊可明顯促進(jìn)人源性肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)條件對(duì)結(jié)果有很大影響，實(shí)驗(yàn)中控制好實(shí)驗(yàn)條件尤為重要。

國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，莪術(shù)油和椒目仁油都含有一定的抗腫瘤活性成分，如莪術(shù)油中含有β-欖香烯，而椒目仁油中則含有α-亞麻酸等，其各自成分的作用將是今后一個(gè)重點(diǎn)研究方向。在實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，可設(shè)計(jì)莪術(shù)油組，椒目仁油組，不同比例混合油組等進(jìn)行藥效學(xué)研究，并對(duì)比治療效果，找出兩種藥油之間的關(guān)系，達(dá)到優(yōu)化處方的目的。

綜上所述，椒莪軟膠囊具有較強(qiáng)的體內(nèi)和體外抗腫瘤作用的活性，其作為中藥制劑用來(lái)治療腫瘤可能具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。如果對(duì)給藥劑型及給藥劑量進(jìn)行深層次研究或優(yōu)化配方，可以降低其不良反應(yīng)，進(jìn)一步增強(qiáng)抗腫瘤作用，可能使椒莪軟膠囊具有更加可靠的臨床應(yīng)用價(jià)值。

［1］徐海燕，林能明，徐利，等．芍藥軟肝方對(duì) H22肝癌、S180肉瘤荷瘤小鼠抑瘤作用研究［J］．中國(guó)腫瘤，2011，20(11):850-854．

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［4］趙婷秀，陳振發(fā)．中藥血清藥理學(xué)方法的研究現(xiàn)狀［J］．湖北中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，5(3):45-46．

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The inhibition effect of transplanted mice tumor with curcuma oil compatibility from Seed oil

XIE Yan-hua，HE Zhong-min，YANG Qian，MIAO Shan，BI Lin-lin，SUN Ji-yuan，WANG Si-wang
(Department of Natural Medicine，School of Medicine，F(xiàn)ourth Military Medical University，Xi’an 710032，China)

ObjectiveTo observe the inhibitory effect of different doses of Curcuma oil compatibility from Seed oil in mice transplanted tumor S180，as well as the in vitro inhibitory effect of human-derived HepG2 cells and colon carcinoma cell line SW480．MethodsSeventy two Kunming mice with tumor xenografts established mouse tumor-bearing animal models．Jiaoe soft capsules administered orally at doses of 0.3，0.6 and 1.2 ml/kg，fluorouracil with 22.5 mg/kg abdominal injection as positive control，administration for 15 days to observe the inhibitory effect of drugs on tumor growth．The preparation of different doses of pepper to Curcuma soft capsules(0． 015625，0． 03125，0． 0625，0.125，0.25，0.5，1，2，4 mg/ml)containing fluorouracil-positive serum and tumor transplantation control group without serum，to observe role of serum inhibition in human derived hepatoma cell line HepG2 and colon cancer cell line SW480 by tetrazolium bromide colorimetric．Jiaoe soft capsules administered 15 h after the impact of human-derived HepG2 at doses of 0.0，6.25，12.5，25.0 μg/ml，cell apoptosis measured by flow cytometry．Results①Jiaoe soft capsules at doses of 0.3，0.6，1.2 ml/kg，the tumor inhibition rates were 19.73%，32.22%and 46.68%respectively．With the increase of the dose，the proportion of the tumor necrosis increased and the active tumor cells decreased gradually．②The inhibition role increased with the doses raising．In vitro minimum drug concentration for by human-derived hepatoma cell line HepG2 was 0. 0625 mg/ml，for strains of SW480 colon cancer cells it was 0.125 mg/ml．③The Jiaoe soft capsule can significantly promote apoptosis of human-derived HepG2 cells．ConclusionJiaoe soft capsule significantly inhibits the mice transplanted tumors by human-derived HepG2 cells and colon carcinoma cell line SW480．Jiaoe soft capsules in clinical practice has broad application prospects．

Jiaoe soft capsule;Anti-tumor;Human hepatoma HepG2 cells;Colorectal carcinoma SW480 cells;Apoptosis

R73;R285.5;R730.52

A

2095-3097(2012)01-0008-05

10.3969/j.issn.2095-3097.2012.01.003

陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2008k10-02)

710032陜西西安，第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)教研室(謝艷華，賀中民，楊 倩，繆 珊，畢琳琳，孫紀(jì)元，王四旺)

王四旺，E-mail:wangsiw@fmmu.edu.cn

2012-03-31 本文編輯:徐海琴)