β-甘露聚糖酶高產(chǎn)菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

曲麗娜，王瑞明，肖靜，唐衛(wèi)華，孫紅梅

1(山東輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，山東濟(jì)南，250353)2(山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南，250353)

β-甘露聚糖酶(β-1，4-D-mannan mannohydrolase，EC 3.2.1.78)是一種能水解均一甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖的主鏈β-1，4-D-甘露糖苷鍵的半纖維素酶，主要來自于微生物［1-2］。作為一種新型工業(yè)用酶，目前存在著發(fā)酵酶活力偏低的缺陷，導(dǎo)致其生產(chǎn)和應(yīng)用成本較高，限制了該酶的廣泛應(yīng)用［3］。

本研究所用菌株Bacillus sp.QYW-1(登錄號:JX524224)在單因素優(yōu)化條件下進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，15～16h產(chǎn)酶活力即達(dá)到最高，其發(fā)酵周期比已報(bào)道的芽孢桿菌屬其它菌株周期明顯縮短，已報(bào)道的最短發(fā)酵周期為20h左右。Akino等［4］報(bào)道的Bacillus sp.AM-001 周期為 24h，Bacillus stearothermophilus 2004［5］和Bacillus sp.N-6［6］的發(fā)酵周期分別為 12h 和 18h。該菌株產(chǎn)生的β-甘露聚糖酶與同類其他來源的酶相比具有良好的熱穩(wěn)定性和pH適應(yīng)性。由于野生菌株產(chǎn)酶活力較低，需要進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。Plackett-Burma(PB)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是進(jìn)行培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化的常用方法。此方法可以從眾多影響因素中快速有效地篩選出最為有效的幾個(gè)因素［7］。本研究以篩選獲得的Bacillus sp.QYW-1為出發(fā)菌株，在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，確定對產(chǎn)酶活力影響最顯著的因素;采用響應(yīng)面(Response Surface Methodology，RSM)找出影響β-甘露聚糖酶產(chǎn)酶的最佳條件，從而達(dá)到對菌株Bacillus sp.QYW-1的產(chǎn)酶條件的優(yōu)化。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)菌株:本實(shí)驗(yàn)室自行篩選獲得的Bacillus sp.QYW-1。

發(fā)酵培養(yǎng)基(經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化獲得):魔芋粉20 g/L，蛋白胨 10 g/L，MgSO45 g/L，NaCl 10 g/L，KCl 6 g/L，NaNO35 g/L，K2HPO44 g/L。

1.2 β-甘露聚糖酶的制備與檢測

接6%的種子液(濃度109CFU/mL)于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，180 r/min培養(yǎng) 15 ～16 h ，8 000 r/min、4℃離心10 min，得粗酶液。

DNS法測定 β-甘露聚糖酶酶活［8］:底物為5 g/L的刺槐豆膠，55℃下反應(yīng)20 min。酶活力定義為上述條件下產(chǎn)生1 μmol還原糖(甘露糖)所需要的酶量定義為1個(gè)酶活單位(U)。

1.3 Plackett-Burman(PB)實(shí)驗(yàn)

選用實(shí)驗(yàn)次數(shù)N=12的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中對菌株產(chǎn)酶影響較大的培養(yǎng)基的7個(gè)組分和培養(yǎng)條件中的1個(gè)因素，如下:魔芋粉，NaCl，NaNO3，KCl，接液量，MgSO4，K2HPO4，蛋白胨以及 3個(gè)虛擬因素X9、X10、X11等11個(gè)因素進(jìn)行考察，每個(gè)因素取高低2個(gè)水平，低水平即“-”，高水平即“+”，高水平約為低水平的1.5倍，以β-甘露聚糖酶的酶活力Y(U/mL)為響應(yīng)值，共進(jìn)行12次實(shí)驗(yàn)以確定每個(gè)因素的影響因子。［7］

在Plackett-Burman(PB)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，運(yùn)用線性函數(shù)進(jìn)行因素篩選，忽略交互作用的影響［7］，線性模型方程見式(1)。

式中:Y為β-甘露聚糖酶酶活力;xi為考察因素;βi是回歸系數(shù)，與xi的影響程度有關(guān)。單一因素的影響由方程(2)計(jì)算:

式中:E(xi)是所考察因素的影響水平，Mi+和Mi-為因素i在實(shí)驗(yàn)中所測得的酶活力達(dá)到最大值和最小值時(shí)的數(shù)值;N為實(shí)驗(yàn)次數(shù)。

具體設(shè)計(jì)見表1，其結(jié)果進(jìn)行方差分析，選取可信度大于95%以上的因素作為影響菌株產(chǎn)β-甘露聚糖酶的主要因素。

表1 Plackett-Burman(PB)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及因素水平

1.4 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)PB實(shí)驗(yàn)所得到的3個(gè)重要因素的效應(yīng)大小的比例設(shè)定它們的變化方向及步長進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其余因素的根據(jù)各因素效應(yīng)的正負(fù)、大小以及單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，正效應(yīng)的因素取高水平濃度，負(fù)效應(yīng)的因素取低水平濃度，迅速的逼近最佳產(chǎn)酶活力區(qū)域以建立有效的響應(yīng)面擬合方程［9］。

1.5 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)PB實(shí)驗(yàn)及最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取的每個(gè)因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平。根據(jù)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)后，分析過程中對實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用二階經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到帶交互項(xiàng)和平方項(xiàng)的回歸分析模型，分析各因素的主效應(yīng)和交互效應(yīng)，最后在一定的水平范圍內(nèi)可求出最佳值。其回歸模型(3):

式中:Y 是 β-甘露聚糖酶酶活力;β0、βi、βii依次是偏移項(xiàng)、線性偏移和二階偏移系數(shù);βij是交互效應(yīng)系數(shù);Xi、Xj是各因素水平值。

回歸方程分別對各自因素水平值求偏導(dǎo)數(shù)可得到響應(yīng)面回歸函數(shù)的駐點(diǎn)，即可得到實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)的最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基組分濃度。根據(jù)PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果及最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果，3因素的選取水平見表2。其余因素的根據(jù)各因素效應(yīng)的正負(fù)、大小以及單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，正效應(yīng)的因素取高水平濃度，負(fù)效應(yīng)的因素取低水平濃度。

表2 響應(yīng)面三因素實(shí)驗(yàn)水平

1.6 產(chǎn)酶最佳條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)BB實(shí)驗(yàn)及Design Expert對回歸方程在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)產(chǎn)酶最佳條件的預(yù)測培養(yǎng)基組分濃度，進(jìn)行產(chǎn)酶活力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取3次試驗(yàn)結(jié)果的平均值，與回歸模型的預(yù)測值進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 Plackett-Burman(PB)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表3。運(yùn)用Design Expert軟件對表1中的β-甘露聚糖酶活力進(jìn)行回歸分析，得到各影響因素的偏回歸系數(shù)及顯著性(表4)。

表3 Plackett-Burman(PB)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

方差分析模型的Prob(P)＞F值為＜0.0001，為高度顯著，表明該模型在所得回歸區(qū)域擬合很好;負(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.932 0，說明相關(guān)性較好，校正決定系數(shù)Adj R2=0.906 5;通常情況下變化系數(shù)CV越低，實(shí)驗(yàn)的可行度和精確度越高，此實(shí)驗(yàn)中CV值等于3.93，表示PB實(shí)驗(yàn)的可信度和精確度良好，精密度(Adeq precision)是有效信號與噪聲的比值，大于4.0視為合理，該實(shí)驗(yàn)中精密度達(dá)到17.784?；貧w方程的方差分析見表5。

表4 β-甘露聚糖酶產(chǎn)酶活力回歸模型方差的方差分析

表5 Plackett-Burman(PB)實(shí)驗(yàn)偏回歸系數(shù)的顯著性分析

以因素X1魔芋粉添加量為例:其偏回歸系數(shù)是10.21，標(biāo)準(zhǔn)誤差是1.48，影響水平為E(x1)=20.43，表明因素X1對β-甘露聚糖酶產(chǎn)酶活力的影響為正效應(yīng)，即隨著魔芋粉添加量的增加，酶活呈增加趨勢，因此在后繼因素優(yōu)化試驗(yàn)中應(yīng)提高魔芋粉的添加量，因素X1的平方和百分值是40.68%，較之其他因素的相應(yīng)值明顯較高，因此顯著性分析結(jié)果最為重要。由表7可明顯看出因素X1(魔芋粉添加量)、X6(MgSO4添加量)、X8(蛋白胨添加量)為主要影響因子，其影響值分別是40.68%、15.40%、37.12%，而3個(gè)虛擬因素 X9、X10和 X11對影響值 (0.0019%、2.51%、0.17%)較低，表明了該線性模型的適用性。經(jīng)影響因素篩選，得到以酶活為響應(yīng)值的線性回歸方程

式中:X1=(魔芋粉 -22)/2;X6=(MgSO4-4.5)/0.5;X8=(蛋白胨-13.5)/1.5

通過方差分析，魔芋粉、蛋白胨和MgSO43個(gè)因素的可信度均大于95%，對β-甘露聚糖酶產(chǎn)酶活力的影響最為顯著，選擇這3個(gè)因素進(jìn)一步作最陡爬坡實(shí)驗(yàn)和RSM實(shí)驗(yàn)。其中魔芋粉高水平好，其它兩個(gè)因素低水平好。其余因素的根據(jù)各因素效應(yīng)的正負(fù)、大小以及單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，正效應(yīng)的因素取高水平濃度，負(fù)效應(yīng)的因素取低水平濃度。

2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)3個(gè)重要因素的效應(yīng)值及單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)定，魔芋粉為正方向，步長為2 g/L;蛋白胨與Mg-SO4為負(fù)方向，步長分別為1 g/L、0.1 g/L。最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成在實(shí)驗(yàn)2與4之間(表6)。

表6 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.3 Box-Behnken優(yōu)化設(shè)計(jì)結(jié)果與響應(yīng)面分析

通過對A:魔芋粉、B:蛋白胨、C:MgSO4進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)(表7)，并利用Design-expert軟件對Box-Behnken實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析后得到模型的二次多項(xiàng)回歸方程為:

式中:R為響應(yīng)值，即β-甘露聚糖酶酶活力;A、B、C分別為魔芋粉、蛋白胨、MgSO4添加量。

表7 RSM實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果

試驗(yàn)編號 因素A魔芋粉 B蛋白胨 C MgSO4響應(yīng)值酶活/(U·mL-1)12 0 + + 142.34 13 0 0 0 227.08 14 0 0 0 231.74 15 0 0 0 229.82

響應(yīng)面分析中對Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合二次模型方差分析如表8。分析結(jié)果表明，回歸方程的多元相關(guān)系數(shù)R2=98.82%，校正決定系數(shù)Adj R2=96.70%，說明回歸方程擬合程度良好。方差分析得知，Prob(P)＞F值為0.000 3(＜0.05為模型顯著)，表明該回歸模型高度顯著，可以用來進(jìn)行相應(yīng)值預(yù)測。魔芋粉添加濃度對菌株產(chǎn)β-甘露聚糖酶酶活力具有正效應(yīng)，P=0.029 9;其次為蛋白胨和Mg-SO4，P值分別為0.041 4和0.049 0(皆＜0.05)為顯著;而失擬項(xiàng)P=0.067 0(＞0.05)不顯著，說明回歸顯著;交互項(xiàng) AB、AC的 P值分別為 0.000 7和0.0013，為顯著;交互項(xiàng)BC不顯著，P=0.436 1。

表8 中心組合設(shè)計(jì)二次模型方差分析

2.4 回歸模型的優(yōu)化

交互項(xiàng)BC(P＞0.05)對菌株產(chǎn)酶影響不顯著，因此采用手動優(yōu)化的方法對回歸模型進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化的結(jié)果見表9。經(jīng)手動優(yōu)化后的回歸方程為:

表9 去掉交互項(xiàng)BC后的優(yōu)化結(jié)果

由表9可知，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.0775＞0.05)，而模型的P＜0.000 1，表明模型高度顯著;同時(shí)軟件分析的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2為98.65%，校正后的Adj R2=0.968 6，表明該模型的擬合程度良好，實(shí)驗(yàn)誤差小，該模型是合適的，可以用此模型對菌株Bacillus sp.QYW-1產(chǎn)β-甘露聚糖酶進(jìn)行分析和預(yù)測;在實(shí)驗(yàn)所選取的因素水平范圍內(nèi)，各因素對產(chǎn)酶活力的影響排序?yàn)槟в蠓郏镜鞍纂耍綧gSO4。

利用Design-Expert對經(jīng)手動優(yōu)化后的回歸方程中的交互項(xiàng)AB和AC繪制響應(yīng)面分析圖和等高圖，橢圓形表示兩個(gè)因素交互作用顯著，圓形表示兩因素交互作用微弱，如圖1和圖2所示。

圖1 魔芋粉A和蛋白胨B對菌株產(chǎn)酶交互影響響應(yīng)面圖及等高圖

圖2 魔芋粉A和MgSO4C對菌株產(chǎn)酶交互影響響應(yīng)面圖及等高圖

圖1 為MgSO4為3.77 g/L條件下，魔芋粉添加量與蛋白胨添加量的交互影響。當(dāng)確定魔芋粉添加量不變時(shí)，隨著蛋白胨添加量的增加，酶活力出現(xiàn)了先增大后減小的趨勢。同樣，固定蛋白胨的添加量，隨著魔芋粉添加量的增加，酶活力業(yè)出現(xiàn)先增大后逐漸降低的趨勢。圖2為蛋白胨添加量為10.26 g/L條件下，魔芋粉和MgSO4添加量的交互影響。當(dāng)確定其中一個(gè)因素的添加量不變時(shí)，隨著另一因素添加量的增加，酶活力出現(xiàn)了先增大后減小的趨勢。上述兩圖的響應(yīng)面圖呈鐘罩型，說明兩者的交互作用比較顯著，與表9的結(jié)果一致(P值小于0.05)。

2.5 最佳發(fā)酵條件的預(yù)測與驗(yàn)證

通過Design Expert軟件對經(jīng)手動優(yōu)化后的回歸方程求解，在試驗(yàn)的因素水平范圍內(nèi)預(yù)測菌株產(chǎn)β-甘露聚糖酶發(fā)酵的最佳條件為:魔芋粉添加量26.51 g/L，蛋白胨添加量10.27 g/L，MgSO4添加量3.77 g/L，由于實(shí)驗(yàn)操作的可行性，將發(fā)酵的最佳條件修正為魔芋粉26 g/L，蛋白胨10 g/L，MgSO43.8 g/L，(其他條件:NaCl 10 g/L，KCl 6 g/L，NaNO36 g/L，K2HPO43 g/L，接液量6%)。在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測得甘露聚糖酶酶活力為233.86 U/mL，與理論預(yù)測值231.475 U/mL的相對誤差很小，說明經(jīng)手動優(yōu)化后的回歸方程對Bacillus sp.QYW-1產(chǎn)β-甘露聚糖酶進(jìn)行的分析和預(yù)測非?？煽?。

3 結(jié)論

對菌株進(jìn)行16S rRNA基因序列測序結(jié)果顯示與 Bacillus amyloliquefaciens strain CICC 23753、Bacillus subtilis isolate WL-3、Bacillus subtilis strain K-C-6 等同源性較高，同源性達(dá)99%，可判斷該菌株為芽孢桿菌屬。利用PB實(shí)驗(yàn)篩選獲得影響該菌株產(chǎn)β-甘露聚糖酶產(chǎn)酶活力的重要因素為魔芋粉、蛋白胨、Mg-SO4。根據(jù)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到的回歸方程，并根據(jù)實(shí)際操作可行性優(yōu)化得到最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為:魔芋粉26 g/L，蛋白胨10 g/L，MgSO43.8 g/L，NaCl 10 g/L，KCl 6 g/L，NaNO36 g/L，K2HPO43 g/L，接液量6%。在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論預(yù)測值高度吻合，相對誤差很小，β-甘露聚糖酶產(chǎn)酶活力由單因素優(yōu)化結(jié)果的115.62 U/mL提高到233.86 U/mL，提高了102%，是野生菌株的最初酶活21.85 U/mL的10.7倍。

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