經(jīng)典BMP信號通路與哺乳動物肺器官發(fā)育

肖愛平 滕鴻琦 李小兵 張明鳳

（福建省發(fā)育與神經(jīng)生物學重點實驗室，福建師范大學生命科學學院 福州 350108）

哺乳動物肺器官原基產(chǎn)生于內(nèi)胚層起源的前腸的一個龍骨形突起，稱為呼吸支囊或肺芽。形成的肺芽先向腹后方生長，接著原始肺芽產(chǎn)生了側(cè)邊分支，肺葉雛形形成。不同物種左邊和右邊次級分支芽的數(shù)量不同。小鼠胚胎發(fā)育至第12.5 d（E12.5），左邊形成一個次級芽，右邊形成四個，這將形成左—右四的肺葉結(jié)構(gòu)。而人類在胚胎肺發(fā)育第5周（5W）左右，伸出兩個左肺芽及三個右肺芽，最后形成左二右三的肺葉結(jié)構(gòu)。在隨后的發(fā)育過程中，細支氣管進一步細分為終末細支氣管，而每個終末細支氣管又進一步分為兩個或更多呼吸性支氣管。在該分支過程中包圍著內(nèi)胚層的間充質(zhì)則形成各級血管及組織間隙細胞。最后，呼吸性支氣管被埋入由無數(shù)間充質(zhì)組織形成的密集網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)之中，形成終末囊（原始的肺泡），它們進一步發(fā)育形成肺泡管、肺泡囊以及成熟的肺泡［1］。

根據(jù)氣道（airway）形成的組織形態(tài)學特征，小鼠肺發(fā)育主要分為5個階段：（1）胚胎肺期（Embryonic Stage，E9-E11.5），從前腸腹側(cè)處形成肺芽，并形成主要支氣管；（2）假腺期（Pseudo glandular Stage，E11.5-E16.5），支氣管進一步分支，產(chǎn)生大量分支結(jié)構(gòu)，同時在間充質(zhì)中形成軟骨和血管；（3）微管期（Canalicular Stage，E16.5-E17.5），支氣管樹分支形態(tài)發(fā)生完成，呼吸上皮細胞進一步分化，血管增加；（4）囊狀期（Saccular Stage，E17.5-P5），肺邊緣上皮管腔膨大，更多的脈管結(jié)構(gòu)包圍末端囊泡，表面活性蛋白產(chǎn)生；（5）泡狀期（Alveolar Stage，P5-P28），次級肺泡繼續(xù)生長，由次級肺泡間隔分成更小的單位，同時肺血管體系成熟［2］。與此對應，人類肺的發(fā)育也經(jīng)歷了相似的5個階段，與小鼠不同的是，人類出生時肺的發(fā)育就已進入泡狀肺階段，而小鼠出生時仍處于囊狀肺階段。

肺原基形成后，其隨后的發(fā)育過程是上皮和間充質(zhì)之間相互作用的結(jié)果，在該過程中，受到多條信號通路的調(diào)控，如BMP、FGF、WNT、SHH等，其中BMP信號通路對調(diào)控肺發(fā)育的至關(guān)重要。BMP（Bone morphogenetic protein）信號通路可分為兩類：第一類為依賴Smads的經(jīng)典BMP信號通路。如圖1所示，胞外BMP配基與位于細胞膜上的TypeⅡ受體結(jié)合后，使同樣位于膜上的TypeⅠ受體磷酸化。TypeⅠ受體由于磷酸化而被激活并與TypeⅡ受體結(jié)合形成受體復合物，接著該復合物與Smad1/5/8聚合體結(jié)合并使其磷酸化而激活。因磷酸化而激活的Smad1/5/8從該復合物解離下來，并與共用Smad蛋白（co-Smad），Smad4結(jié)合形成復合物（推測是兩分子的相關(guān)Smads和一分子的Smad4，形成三明治結(jié)構(gòu)）。隨后該Smad蛋白復合物轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，作用于靶基因如Id1，啟動或抑制這些基因的表達，從而BMPs的信號得以表達。第二類為不依賴Smads的非經(jīng)典BMP信號通路，即MAP（mitogenactivated protein kinases）激酶途徑，包括 JNKs、p38、ERKs等，對細胞增殖與分化有重要作用［3］。在這個途徑中，激活的受體復合物不與Smad1/5/8作用，而是與有絲分裂蛋白激酶相關(guān)蛋白作用，啟動下游信號通路。目前，多數(shù)學者主要從組織形態(tài)、細胞分化和基因調(diào)控三個層次上，通過基因敲除或轉(zhuǎn)基因過表達等方式，研究BMP信號通路調(diào)控哺乳動物肺發(fā)育的作用機制。并且，隨著肺部疾病對人類生活影響日益的加深，會有更多的研究將肺部疾病與BMP信號通路聯(lián)系起來，這對于發(fā)展新的醫(yī)療技術(shù)、治療先天性和后天性肺部疾病，均有著重要的理論意義。

圖1 經(jīng)典BMP信號通路示意圖［4］

1 經(jīng)典BMP信號通路調(diào)控哺乳動物肺器官發(fā)育的研究進展

1.1 BMP信號通路配體 BMPs（bone morphogenetic proteins），骨形態(tài)發(fā)生蛋白，是TGF-β家族的一個亞族，其名稱來由為在大鼠的非成骨部位加入這類蛋白能誘導骨或軟骨的形成。至今已有20多種BMPs被發(fā)現(xiàn)，除了能誘導骨及軟骨組織發(fā)生，它們對其他器官如牙齒、腎、肺、毛發(fā)、皮膚、肌肉等發(fā)育過程也有重要作用。BMPs分子量介于30～35 kD之間，是一類二硫鍵連接的二聚體蛋白。大部分BMPs的單體上都有7個保守半胱氨酸殘基，其三維結(jié)構(gòu)和其他TGF-β家族成員相似。BMPs以大分子量的前體蛋白形式分泌，在RXXR保守序列位點被水解后，去除N端，由C端部分構(gòu)成成熟的、具有生物活性的 BMPs［5］。

目前，在小鼠肺發(fā)育中表達的BMP配體包括Bmp2、Bmp3、Bmp4、Bmp5、Bmp6 和 Bmp7。用原位雜交的方法在胚胎期小鼠肺中檢測不到Bmp2［6］，但在低氧誘導成體小鼠的肺動脈高血壓模型中，發(fā)現(xiàn)Bmp2半突變（Bmp2+/-）的小鼠肺表現(xiàn)出比野生型的小鼠肺更嚴重的癥狀，說明Bmp2表達水平降低是促進肺動脈高血壓的原因之一［7］。此外，在人類非小細胞肺癌（NSCLC）組織中，發(fā)現(xiàn)BMP2表達水平顯著上升；體外培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)，BMP2能刺激A549及H7249等人肺癌細胞系遷移及擴散；向裸鼠注射A549癌細胞，重組的BMP2可促進形成腫瘤的生長，而用BMP2抗體抑制BMP2的活性可減弱腫瘤形成速度。這些事實表明BMP2在肺癌形成過程中有重要的生物功能［8］。S Vukicevic等人發(fā)現(xiàn)Bmp3在小鼠胚胎肺發(fā)育前期的上皮細胞表達。用不同種系的小鼠交配獲得轉(zhuǎn)基因鼠，Bmp3失活突變無任何肺部異常，但C57BL/6種系小鼠的Bmp3失活突變導致在圍產(chǎn)期肺部發(fā)育異常［9］，但其調(diào)控肺發(fā)育的機制尚不清楚。

Bmp4是目前在肺發(fā)育中研究最為透徹的一個成員，對肺器官發(fā)育有極為重要的調(diào)控作用。在假腺期及微管期，Bmp4在遠端上皮末端及鄰近端氣道的間充質(zhì)高水平表達，而近端上皮的表達要弱得多；臨近出生前，其在末端囊泡上皮的表達減少，同時在毛細血管內(nèi)皮細胞中也可檢測到其表達［10］。Bmp4完全失活突變小鼠在肺原基形成之前死亡［11］。用SP-C啟動子在肺上皮條件性過表達Bmp4，自E15.5起，轉(zhuǎn)基因的小鼠肺比對照組小，且氣道管腔擴大、間充質(zhì)變厚；有些小鼠可存活到出生，但很快死亡。組織切片發(fā)現(xiàn)這些異常的肺邊緣部分有顯著膨大的末端囊泡，且有明顯的肺泡間隔發(fā)育異常；檢測近端上皮細胞標志物CC-10及遠端上皮細胞標志物SP-C發(fā)現(xiàn)，支氣管克拉拉（Clara）細胞無顯著變化，而遠端TypeⅡ上皮細胞減少［6］，說明Bmp4對調(diào)控肺近遠端上皮細胞分化，維持近遠端細胞群的平衡有重要作用。Bmp5由短耳（short ear）基因突變后的序列編碼。原位雜交發(fā)現(xiàn)，BMP5從E10.5至E16.5在整個肺間充質(zhì)都有表達［12］；Bmp5純合子失活突變導致新出生的小鼠肺中出現(xiàn)有液態(tài)物質(zhì)的泡囊，在某些種系中，甚至雜合子就能產(chǎn)生這些異常表型［13］，這些異常表型產(chǎn)生的具體原因尚不清楚。在成體小鼠肺中可檢測到Bmp6［14］，但Bmp6突變鼠中未見任何肺部異常，推測Bmp6對小鼠肺發(fā)育的作用不如Bmp4那樣顯著，缺失后其功能可通過其他 Bmps補償。Bmp7又稱為［OP］-1（osteogenic protein 1），E11.5-E13.5其在整個上皮都有表達，與Bmp4在小鼠肺中的表達模式一致，到E15，其在上皮及間充質(zhì)的表達均變?nèi)?。Bmp7純合子突變對胚胎期的肺發(fā)育沒有明顯影響，能正?；畹匠錾f明在胎肺發(fā)育過程中Bmp7的功能也可通過其他BMPs補償［6］。

配體BMPs的表達與肺部疾病的產(chǎn)生密切相關(guān)。在低氧誘導的肺動脈高血壓中，Bmp4的表達上調(diào)，而在Bmplaz/+小鼠中，低氧肺動脈高血壓所表現(xiàn)出的癥狀較野生型小鼠輕緩，說明Bmp4可促進血管平滑肌細胞增殖而促成低氧肺動脈高血壓的形成［7］；在過敏源誘導的輕度哮喘病人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)BMP7表達增強［15］；用卵清蛋白誘導的氣道炎癥中，Bmp2、Bmp4、Bmp6 的表達上調(diào)，而 Bmp5、Bmp7 的表達水平下調(diào)［16］，這些結(jié)果說明BMPs對呼吸道疾病的發(fā)病機制有重要的調(diào)控作用。

1.2 BMP信號通路受體 BMPs通過兩種具有絲氨酸-蘇氨酸激酶活性的膜蛋白傳遞信號，即TypeⅠ和TypeⅡ受體。在沒有TypeⅡ受體的情況下，BMPs也能與TypeⅠ受體結(jié)合，只是在TypeⅡ受體存在時，兩者的親和性顯著增強［17］。TypeⅡ受體的分子量為 70～80 kD，TypeⅠ受體的分子量為 50～55 kD。兩種類型受體有相同的結(jié)構(gòu)特性，即有一個相對較短的胞外結(jié)構(gòu)，單個跨膜結(jié)構(gòu)域及含有一個絲氨酸-蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。Ⅰ型受體的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域有一個特征性的GS域（glycine and serine-rich domain，即富含氨基乙酸及絲氨酸的結(jié)構(gòu)域），位于絲氨酸蘇氨酸激酶區(qū)域的N端，TypeⅡ受體無此結(jié)構(gòu)［5］。在沒有配體激活時，兩種受體在細胞表面以前同型或異型二聚體形式存在，當Ⅱ型受體與胞外配體結(jié)合后，其構(gòu)象改變而被激活，并磷酸化Ⅰ型受體的GS域，該過程是絲氨酸-蘇氨酸激酶受體傳遞BMPs信號的一個重要步驟。

在哺乳動物體內(nèi)，傳遞BMP信號的TypeⅡ受體有 3種，即 BMPR-Ⅱ、ActR-Ⅱ、ActR-ⅡB。BMPR-Ⅱ只傳遞BMPs信號，是BMPs的特異性受體，而其他兩種為 activins、myostatin和 BMPs共有受體［4］。Bmpr2（編碼BMPR-Ⅱ）突變小鼠在E9.5死亡［18］；Acvr2（編碼ActR-Ⅱ）突變小鼠表現(xiàn)為下顎骨發(fā)育不全及骨骼畸形［19］；Acvr2b（編碼 ActR-ⅡB）突變小鼠表現(xiàn)為心臟缺陷、四肢發(fā)育不對稱性和脊椎畸形［20］，表明BMPR-Ⅱ是調(diào)控肺發(fā)育的主要受體。肺動脈高血壓（Pulmonary Arterial Hypertension，PAH）是一種威脅生命的疾病，伴常染色體顯性遺傳，其病理特征為血管內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞過度增殖，導致血管內(nèi)徑變小，從而引起肺動脈血壓增大。Bmpr2與PAH有著密切關(guān)系。血管內(nèi)皮細胞中半敲除或完全敲除Bmpr2的鼠肺中有PAH的前兆，表明BMPR-Ⅱ?qū)Ψ窝軆?nèi)皮細胞及平滑肌細胞的有絲分裂有重要的調(diào)控作用［21］。70%的家族性肺動脈高血壓（familial PAH）病人及10%～40%的先天性肺動脈高血壓（idiopathic PAH）病人存在 Bmpr2突變［22-23］，表明Bmpr2是導致肺動脈高血壓的原因之一。

目前在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)7種Ⅰ型受體，即Alk1-7。而在肺中傳導BMP信號的Ⅰ型受體有三種：Alk2/ActR-1、Alk3/Bmpr1a和 Alk6/Bmpr1b。Alk2只在肺的間充質(zhì)中表達［24］；Alk3在肺上皮和間充質(zhì)中均有強烈表達；Alk6在近端內(nèi)皮細胞有高表達，而在遠端肺上皮和間充質(zhì)細胞中表達量較低［25］。三種類型受體在肺組織上表達模式差異說明，Alk3是在肺遠端上皮傳遞Bmps信號的主要Ⅰ型受體。用傳統(tǒng)的基因突變失活的方法使Alk2及Alk3功能缺失，導致胚胎在肺形態(tài)發(fā)生之前（約E7.5-E9.5）死亡［26-28］；而Alk6失活突變小鼠只表現(xiàn)肢芽發(fā)育缺陷，而對包括肺在內(nèi)的軟內(nèi)臟器官的發(fā)育無影響［29-30］。此外，用Cre-loxP體系在小鼠肺上皮條件性敲除Alk2無任何肺部異常。同樣用Cre-loxP體系在小鼠肺發(fā)育早期在肺上皮條件性敲除Alk3，由于體內(nèi)正常的Bmps信號通路被打亂，導致肺發(fā)育不正常，表現(xiàn)為新生鼠肺泡未充氣，內(nèi)充滿不定形的液態(tài)物質(zhì)，肺泡不能正常擴張，出現(xiàn)呼吸窘迫癥狀，導致小鼠在出生后數(shù)十小時內(nèi)死亡。同時發(fā)現(xiàn)，在這些發(fā)育異常的鼠肺中，近端上皮細胞無顯著變化，而遠端上皮細胞顯著減少，即存在肺部近端化的趨勢。此外，早時期的肺氣道上皮分支減少、管腔擴大［31］。這些結(jié)果表明Alk3與Bmp4一樣，參與調(diào)控了上皮的分化及增殖。

1.3 BMP信號通路下游轉(zhuǎn)錄因子Smads 在哺乳動物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)8種不同的Smads，即Smad1-8。Smad1/5/8是BMP信號通路特異的相關(guān)Smads，傳導BMP信號。Smad2、Smad3傳遞TGF-β/activin信號，但在某些類型細胞中發(fā)現(xiàn)這些蛋白的分工并不明確。Smad4是哺乳動物體內(nèi)唯一的co-Smad，為BMP、TGF-b和activin信號通路共用。Smad6、Smad7是抑制性的Smads（I-Smads）。Smads由高度保守的N端及C端，分別稱為Mad同源域MH1、MH2以及一個長度可變的連接部分構(gòu)成。MH1由大約130個氨基酸組成，且在Smad1/5/8及Smad4上高度保守，而與Smad6、Smad7的結(jié)構(gòu)相差甚遠。MH2是一個約200個氨基酸長度的結(jié)構(gòu)域，其在3種類型的Smads蛋白之間結(jié)構(gòu)保守，是Smad1/5/8與受體的相互作用區(qū)。Smad1/5/8在C末端還有一個SSXS模體（Ser-Ser-X-Ser motif），該位點可被Ⅰ型受體磷酸化［17］。連接部分在氨基酸的數(shù)目及排列順序都高度可變，含有MAP激酶磷酸化位點。這些位點應答MAP激酶激活而被磷酸化時，能阻止Smads蛋白復合物轉(zhuǎn)移到核內(nèi)［32］。在沒有受體激活時，MH1和MH2結(jié)合，阻礙彼此相互作用；當MH2被Ⅰ型受體c端保守的Ser-Ser-X-Ser模體磷酸化后，其從被MH1抑制狀態(tài)解放出來，并與Smad4相互作用［33］，從而傳導BMPs信號。

Smad1在小鼠胚胎肺發(fā)育過程中有著動態(tài)表達。E12.5時，Smad1主要在邊緣氣道上皮表達，間充質(zhì)幾乎檢測不到其表達，至胚胎中后期，其在上皮的表達減少，而在間充質(zhì)的表達上調(diào)；在胚胎后期，甚至在血管中也能檢測到。XU等人用Cre-Loxp體系在小鼠肺上皮條件性敲除Smad1，發(fā)現(xiàn)新生小鼠伴有呼吸窘迫癥，出生后數(shù)小時死亡；該鼠肺囊泡內(nèi)無空氣，仍是不定形的液態(tài)物質(zhì)，導致肺不張（atelectasis）；用同樣的體系構(gòu)建Smad5敲除鼠肺，該條件性敲除的肺中無異常表型，說明鼠肺中Bmps信號的傳遞傾向于依賴Smad1［34］。此外，用失活突變的方式敲除Smad5則導致胚胎死亡（約E13.5）［35］，說明Smad5是小鼠胚胎正常發(fā)育所必須的，其調(diào)控肺發(fā)育的具體機制尚待研究。Smad8缺陷小鼠在胚胎期及出生后均沒有明顯的發(fā)育異常［36-37］。3種Smads敲除后的表型差異說明Smad1是經(jīng)典BMP信號通路主要的胞內(nèi)信號傳遞者。已報道在一位先天性肺動脈高血壓病人身上發(fā)現(xiàn)其SMAD8存在無義突變［38］。Huang等人也發(fā)現(xiàn)敲除Smad8導致遠端肺動脈平滑肌細胞增生，平滑肌層增厚，與肺動脈高血壓的癥狀相似，一部分Smad8突變體還有肺腺癌的癥狀，說明Smad8對控制細胞生長有一定的作用［37］。

Smad4是至今在脊椎動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的唯一通用的Smad。Smad4失活突變小鼠由于原腸胚形成缺陷及內(nèi)臟中胚葉異常，胚胎在E7.5死亡［39］，與Bmp4及Bmpr1a突變小鼠的表型相似，由此可推測Smad4對BMPs信號的傳遞有著不可或缺的作用。

抑制性 Smads（I-Smads），包括 Smad6、Smad7。Smad7能抑制TGF-β和BMPs信號，而Smad6優(yōu)先抑制BMPs信號（preferentially），它們作用的分子機制存在幾種假說。第一種假說認為I-Smads通過其MH2結(jié)構(gòu)區(qū)與被TypeⅡ受體激活的Ⅰ型受體結(jié)合，只是結(jié)合后并不從復合物上脫落下來，從而阻礙了Smad1/5/8的激活［40］。也有認為Smad6通過和Smad4競爭與Smad1的結(jié)合而抑制BMPs信號［41］。此外，I-Smads的表達還受到BMPs的調(diào)控，對BMPs信號形成一個負反饋調(diào)節(jié)［42］。

1.4 BMP信號通路拮抗物 所謂BMP拮抗物指的是在胞外區(qū)域可直接與BMPs作用而阻止其與相關(guān)受體作用的一類生物分子。在哺乳動物體內(nèi)已有多種BMP拮抗物被發(fā)現(xiàn)，在肺發(fā)育過程中調(diào)控BMP信號的拮抗物有Follistatin-like 1、Noggin和Gremlin。

1.4.1 Follistatin-like 1（Fstl1） Fstl1是一種新近發(fā)現(xiàn)的BMP蛋白拮抗物，其本質(zhì)是一種卵泡狀分泌糖蛋白。研究表明，F(xiàn)stl1可直接與BMP4作用，從而調(diào)節(jié)BMP4-Smad1/5/8信號通路。Fstl1表達于肺遠端氣道間充質(zhì)及血管內(nèi)皮細胞。Fstl1突變小鼠在E17.5時，肺葉呈氣泡狀，而非野生鼠肺中的錐形；組織切片發(fā)現(xiàn)，其肺近端上皮不規(guī)則且膨大，而遠端上皮囊泡較??；敲除小鼠能活到出生，而出生后由于呼吸困難缺氧而全身發(fā)紫，數(shù)分鐘后死亡［43］。分析其突變表型發(fā)現(xiàn)其對正常的氣管軟骨形成及肺泡成熟有重要的作用。

1.4.2 Noggin Noggin是分子量約32 kDa的糖蛋白，對BMP2及BMP4有很強的拮抗作用，而對BMP7作用較弱。Groppe等人報道了Noggin-BMP7復合物的晶體結(jié)構(gòu)，并證明Noggin通過封閉Ⅰ、II型受體作用的交界面的抗原決定族而調(diào)控BMP信號［44］。Molly等人用SP-C啟動子條件性地使Noggin在小鼠肺上皮條件性過表達，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠的肺要比對照組的肺小得多。雖然能活到出生，但它們出身后很快死亡。形態(tài)分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因的肺近端上皮正常，但間充質(zhì)較松散；遠端上皮分化受到抑制，遠端內(nèi)皮有立方形的近端上皮細胞，表明Noggin參與了近遠端上皮細胞的分化過程。此外還伴隨著肺動脈平滑肌增厚，與肺動脈高血壓（PAH）的癥狀相似［45-46］。

1.4.3 Gremlin Gremlin編碼一種23～28 kDa的糖基化分泌蛋白，可作用于BMP-2、BMP-4和BMP7，抑制它們的生物功能［45］。除了在胞外抑制BMPs生物功能之外，Sun及其同伴證實在胚胎肺中，Gremlin還能在胞內(nèi)與BMPs前體蛋白結(jié)合，阻止成熟BMPs分泌，從而阻礙BMPs信號傳遞［47］。Gremlin還可以以不依賴BMP的方式與細胞表面蛋白相互作用，通過調(diào)節(jié)細胞之間的作用從而對BMPs起拮抗作用［48-49］。WEI SHI等人通過 RT-PCR發(fā)現(xiàn)Gremlin在胚胎肺發(fā)育的假腺管期的表達量最高，在胚胎肺成熟階段表達量下降（E18.5-P1）；原位雜交顯示其主要分布在邊緣肺間充質(zhì)及上皮，在E11.5肺芽形成位點及E16.5后大氣道有較高的表達［50］。Gremlin缺陷小鼠由于腎缺失及肺發(fā)育缺陷而在出生前死亡，說明Gremlin是保證肺的正常發(fā)育所必需的。肺體外培養(yǎng)實驗結(jié)果表明，加入Gremlin的反義多聚核苷酸鏈后，肺上皮的分支增加，即其可通過負調(diào)控上皮的分支形態(tài)發(fā)生而參與肺發(fā)育過程。在低氧誘導的肺動脈高血壓中，檢測到Gremlin表達上調(diào)了，在肺動脈高壓病人身上也發(fā)現(xiàn)該蛋白表達水平上升［51］，說明Gremlin可能參與了肺動脈高壓的病理過程。

1.5 其他BMP信號通路調(diào)控分子

1.5.1 Smurf1（Smad ubiquitin regulatory factor 1）

Smurf1屬于HECT家族E3連接酶成員。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，Smurf1在早期鼠胎肺的表達很低，在隨后的發(fā)育過程中逐步增加。E11.5時，Smurf1只在小部分間充質(zhì)細胞檢測到；至E14.5，雖然間充質(zhì)也可檢測到，但主要在上皮細胞表達；至P1，Smurf1幾乎在所有肺細胞都有表達，在細支氣管上皮細胞的表達尤為強烈［52］。目前關(guān)于Smurf1對BMPs的調(diào)控機制有幾種假說。第一種假說認為［40］，Smurf1可誘導ISmads從細胞核輸出，并輔助其與Ⅰ型受體相互作用，從而使BMP信號受阻；第二種假說認為，Smurf1還可誘導膜上的BMP受體降解，使細胞膜上的受體減少而減弱BMP信號。在野百合堿（MTC）及低氧誘導的肺動脈高血壓中，Smurf1的水平顯著提高；體外培養(yǎng)細胞過表達Smurf1誘導BMPRs降解，而Smurf1顯著失活則導致受體積累［53］；還有假說認為Smurf1可與R-Smads相互作用，使其通過泛激素-蛋白酶途徑降解。在肺外植體培養(yǎng)實驗中，導入Smurf1表達載體，使其在培養(yǎng)液中表達，發(fā)現(xiàn)其能抑制肺上皮分支，而當Smad1與其同時表達或加入可溶解的BMP4時，其對上皮分支抑制作用解除了［52］。已有研究表明，Smurf1過表達導致Smad1和Smad5表達降低，而對Smad8無影響。由此推斷，Smurf1在小鼠胚胎肺上皮能特異地促進Smad1及Smad5的泛激素化并被降解，從而調(diào)節(jié)BMP4對小鼠胚胎肺發(fā)育的影響［54］。

1.5.2 NDST1 NDST1（N-deacetylase/N-sulfotransferase-1）N-乙?；?N-磺基轉(zhuǎn)移酶，參與合成HSPGs的硫酸乙酰肝素（HS）鏈。HSPGs（heparan sulfate proteoglycans），即乙酰肝素蛋白多糖，參與調(diào)控包括BMPs信號在內(nèi)的多條信號通路。Fan等人報道Ndst1-/-的小鼠出現(xiàn)肺不張癥狀及新生鼠呼吸窘迫癥［55-56］。進一步分析檢測發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)肺不張癥狀的原因為表面活性蛋白分泌減少，并存在細胞分化缺陷，同時下游的BMP信號增強。體外培養(yǎng)實驗證明NDST1的缺失能明顯減弱BMPs進入細胞的能力。即BMPs通過HSPGs的HS鏈與HSPGs作用并結(jié)合到細胞表面，從而進入細胞內(nèi)，使得可自由參與BMP通路的BMPs減少，對BMPs信號起負調(diào)節(jié)作用［57］。

2 研究展望

肺是生物體內(nèi)長久進化的一個重要器官，生物體出生后能否正常存活取決于其在母體內(nèi)是否有一個正常的發(fā)育過程?？傮w上可將肺的發(fā)育可分為兩個階段：肺的生長（lung growth）和肺的成熟（lung maturation）。生長過程指的是支氣管樹及末端囊泡形成過程；成熟是指末端上皮形成具有氣體交換功能的成熟肺泡過程。兩個過程相互協(xié)調(diào)，保證肺的正常發(fā)育。該過程還受到多條信號通路的調(diào)控，如FGF、SHH、BMP、WNT等，其中BMP信號通路對于肺發(fā)育有不可替代的作用。同時，各條信號通路并非獨立作用，一條信號通路的改變也可能導致其他信號通路的變化，即通路之間存在信號應答（crosstalk）。如在Smad1條件性敲除鼠肺中，Bmp信號的減弱導致Wif1（Wnt inhibitory factor 1）的表達下調(diào)，從而使得該鼠肺中WNT信號增強。

目前人們對BMP信號通路與肺發(fā)育的研究主要是通過在肺中對BMP信號通路成員編碼基因進行敲除或過表達，通過肺的表型來推斷該基因調(diào)控肺發(fā)育的機制。有大量的實驗研究表明經(jīng)典BMP信號通路中關(guān)鍵成員的缺失或過表達會引發(fā)許多肺部疾病，如纖維化肺、肺動脈高血壓，哮喘及肺癌等。因而，我們可以對病變肺組織中BMP信號通路成員進行外源調(diào)控，使其盡量恢復到正常水平，達到緩減甚至治愈疾病的目的。同時新近的研究手段推進了研究深度，如利用染色質(zhì)免疫共沉淀芯片（ChIP-chip）技術(shù)，能鑒定出各類轉(zhuǎn)錄因子與靶基因的作用位點，這些研究將造福人類，為未來肺部疾病的藥物制備提供重要的理論依據(jù)。

［1］ 施玨平，滕鴻琦，肖愛平，等.經(jīng)典WNT信號通路與哺乳動物肺器官發(fā)育［J］.生命科學，2011，23（12）：1-9.

［2］ Maeda Y，Dave V，Whitsett J A.Transcriptional control of lung morphogenesis［J］.Physiol Rev，2007，87（1）：219-244.

［3］ Derynck R，Zhang Y E.Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-beta family signalling［J］.Nature，2003，425（6958）：577-584.

［4］ Miyazono K，Kamiya Y，Morikawa M.Bone morphogenetic protein receptors and signal transduction ［J］.J Biochem，2010，147（1）：35-51.

［5］ Kawabata M，Imamura T，Miyazono K.Signal transduction by bone morphogenetic proteins［J］.Cytokine Growth Factor Rev，1998，9（1）：49-61.

［6］ Bellusci S，Henderson R，Winnier G，et al.Evidence from normal expression and targeted misexpression that bone morphogenetic protein （Bmp-4）plays a role in mouse embryonic lung morphogenesis［J］.Development，1996（9）：49-61.

［7］ Anderson L，Lowery J W，F(xiàn)rank D B，et al.Bmp2 and Bmp4 exert opposing effects in hypoxic pulmonary hypertension ［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2010，298（3）：R833-842.

［8］ M E，Langenfeld S E，Calvano FA-N，et al.The mature bone morphogenetic protein-2 is aberrantly expressed in non-small cell lung carcinomas and stimulates tumor growth of A549 cells［J］.Carcinogenesis，2003，24（9）：1445-1454.

［9］ Daluiski A，Engstrand T，Bahamonde M E，et al.Bone morphogenetic protein-3 is a negative regulator of bone density［J］.Nat Genet，2001，27：84-88.

［10］ Weaver M，Batts L，Hogan B L.Tissue interactions pattern the mesenchyme of the embryonic mouse lung［J］.Dev Biol，2003，258（1）：169-184.

［11］ Winnier G，Blessing M，Labosky P A，et al.Bone Morphogenetic protein-4 （BMP-4）is required for mesoderm formation and patterning in the mouse［J］.Genes Dev，1995（9）：2105-2116.

［12］ King J A，Marker P C，Seung K J，et al.BMP5 and the molecular，skeletal，and soft-tissue alterations in short ear mice［J］.Dev Biol，1994，166（1）：112-122.

［13］ Green M C.Mechanism of the pleiotropic effects of the short-ear mutant gene in the mouse ［J］.J Exp Zool，1968，167（2）：129-150.

［14］ Ozkaynak E，Schnegelsberg P N J，Jin D F，et al.Osteogenic protein-2［J］.J Biol Chem，1992，267：25220-25227.

［15］ H H，Kariyawasam G X，Julia Barkans，et al.Basal Expression of Bone Morphogenetic Protein Receptor Is Reduced in Mild Asthma.Am J Respir［J］.Crit Care Med，2008，177：1074-1081.

［16］ Rosendahl A，Pardali E，Speletas M，et al.Activation of bone morphogenetic protein/Smad signaling in bronchial epithelial cells during airway inflammation［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2002，27（2）：160-169.

［17］ Rosenzweig B L，Imamura T，Okadome T，et al.Cloning and characterization of a human type II receptor for bone morphogenetic proteins［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1995，92（17）：7632-7636.

［18］ Beppu H，Kawabata M，Hamamoto T，et al.BMP type II receptor is required for gastrulation and early development of mouse embryos［J］.Dev Biol，2000，221：249-258.

［19］ Matzuk M M，Kumar T R，Bradley A.Different phenotypes for mice deficient in either activins or activin receptor type II［J］.Nature，1995，374：356-360.

［20］ Oh S P，Li E.The signaling pathway mediated by the type IIB activin receptor controls axial patterning and lateral asymmetry in the mouse［J］.Genes Dev，1997，11（14）：1812-1826.

［21］ Hong K H，Lee Y J，Lee E，et al.Genetic ablation of the BMPR2 gene in pulmonary endothelium is suf?cient to predispose to pulmonary arterial hypertension［J］.Circulation，2008，118：722-730.

［22］ Lane K B，Machado R D，Pauciulo M W，et al.Heterozygous germline mutations in BMPR2，encoding a TGF-b receptor，cause familial primary pulmonary hypertension［J］.Nat Genet，2000，26：81-84.

［23］ Deng Z，Morse J H，Slager S L，et al.Familial primary pulmonary hyper-tension（gene PPH1）is caused by mutations in the bone morphogenetic protein receptor-II gene［J］.Am J Hum Genet，2000，67：737-744.

［24］ Verschueren K，Dewulf N，Goumans M J，et al.Expression of type I and type IB receptors for activin in midgestation mouse embryos suggests distinct functions in organogenesis［J］.Mech Dev，1995，52（1）：109-123.

［25］ Dewulf N，Verschueren K，Lonnoy O，et al.Distinct spatial and temporal expression patterns of two type I re－ceptors for bone morphogenetic proteins during mouse embryogenesis［J］.Endocrinology，1995，136（6）：2652-2663.

［26］ Y M，A S，N U，Behringer R R.Bmpr encodes a type I bone morphogenetic protein receptor that is essential for gastrulation during mouse embryogenesis ［J］.Genes Dev，1995，9：3027-3037.

［27］ Z G，EM R，J S，et al.The type I serine/threonine kinase receptor ActRIA （ALK2）is required for gastrulation of the mouse embryo［J］.Development，1999，126：2551-2561.

［28］ Mishina Y，Crombie R，Bradley A，et al.Multiple roles for activin-like kinase-2 signaling during mouse embryogenesis［J］.Dev Biol，1999，213（2）：314-326.

［29］ Yi S，Daluiski A，Pederson R，et al.The type I BMP receptor BMPRIB is required for chondrogenesis in the mouse limb［J］.Development，2000，127（3）：621-630.

［30］ ST B，JJ M，SM D.Combinatorial signaling through BMP receptor IB and GDF5：shaping of the distal mouse limb and the genetics of distal limb diversity［J］.Development，2000，127：605-619.

［31］ Sun J，Chen H，Chen C，et al.Prenatal lung epithelial cell-specific abrogation of Alk3-bone morphogenetic protein signaling causes neonatal respiratory distress by disrupting distal airway formation ［J］.Am J Pathol，2008，172（3）：571-582.

［32］ Dupont S，Mamidi A，Cordenonsi M，et al.FAM/USP9x，a deubiquitinating enzyme essential for TGFb signaling，controls Smad4 monoubiquitination ［J］.Cell Res，2009，136：123-135.

［33］ Abdollah S，Macias-Silva M，Tsukazaki T，et al.TGF-betaRI phosphorylation of Smad2 on Ser465 and Ser467 is required for Smad2-Smad4 complex formation and signaling［J］.Biol Chem，1997，272：27678-27685.

［34］ Xu B，Chen C，Chen H，et al.Smad1 and its target gene Wif1 coordinate BMP and Wnt signaling activities to regulate fetal lung development［J］.Development，2011，138（5）：925-935.

［35］ Chang.H，Huylebroeck.D，Verschueren.K，et al.Smad5 knockout mice die at mid-gestation due to multiple embryonic and extraembryonic defects.Development［J］.1999，126：1631-1642.

［36］ Hester M，Thompson J C，Mills J，et al.Smad1and Smad8 function similarly in mammalian central nervous system development［J］.Mol Cell Biol，2005，25：4683-4692.

［37］ Huang Z，Wang D，Ihida-Stansbury K，et al.Defective pulmonary vascular remodeling in Smad8 mutant mice［J］.Hum Mol Genet，2009，18（15）：2791-2801.

［38］ Shintani M，Yagi H，Nakayama T，et al.A new nonsense mutation of SMAD8 associated with pulmonary arterial hypertension［J］.J Med Genet，2009，46（5）：331-337.

［39］ Sirard C，de la Pompa J L，Elia A，et al.The tumor suppressor gene Smad4/Dpc4 is required for gastrulation and later for anterior development of the mouse embryo［J］.Genes Dev，1998，12：107-119.

［40］ Miyazono K.Regulation of TGF-b family signaling by inhibitory Smads in The TGF-β Family ［M］.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2008.

［41］ Hata A，Lagna G，Massague J，et al.Smad6 inhibits BMP/Smad1 signaling by specifically competing with the Smad4 tumor suppressor［J］.Genes Dev，1998，12（2）：186-197.

［42］ Ishida W，Hamamoto K，Kusanagi K，et al.Smad6 is a Smad1/5-induced Smad inhibitor：Characterization of bone morphogenetic protein-responsive element in the mouse Smad6 promoter［J］.J Biol Chem，2000，275：6075-6079.

［43］ Y G，Y D，M Y，et al.Follistatin-like 1 （Fstl1）is a bone morphogenetic protein （BMP）4 signaling antagonist in controlling mouse lung development［J］.Proc Natl Acad，2011，108：7058-7063.

［44］ Groppe J，Greenwald J，Wiater E，et al.Structural basis of BMP signaling inhibition by Noggin，a novel twelve-membered cystine knot protein［J］.J Bone Joint Surg Am，2003，85-A Suppl 3：52-58.

［45］ E C，AN E，E G.Bone morphogenetic proteins，their antagonists，and the skeleton［J］.Endocr Rev，2003，24（2）：218-235.

［46］ Weaver M，Yingling J M，Dunn N R，et al.Bmp signaling regulates proximal-distal differentiation of endoderm in mouse lung development ［J］.Development，1999，126（18）：4005-4015.

［47］ Sun J，Zhuang F F，Mullersman J E，et al.BMP4 activation and secretion are negatively regulated by an intracellular gremlin-BMP4 interaction［J］.J Biol Chem，2006，281（39）：29349-29356.

［48］ B C，DG.B，Plisov S，et al.Cutting edge：bone morphogenetic protein antagonists Drm/Gremlin and Dan interact with Slits and act as negative regulators of monocyte chemotaxis［J］.J Immunol，2004，173：5914-5916.

［49］ H S，S M，E M，et al.Bone morphogenic protein antagonist Drm/gremlin is a novel proangiogenic factor［J］.Blood，2007，109：1834-1840.

［50］ Shi W，Zhao J，Anderson K D，et al.Gremlin negatively modulates BMP-4 induction of embryonic mouse lung branching morphogenesis［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2001，280（5）：L1030-1039.

［51］ Costello C M，Howell K，Cahill E，et al.Lung-selective gene responses to alveolar hypoxia：potential role for the bone morphogenetic antagonist gremlin in pulmonary hypertension ［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2008，295（2）：L272-284.

［52］ Shi W，Chen H，Sun J，et al.Overexpression of Smurf1 negatively regulates mouse embryonic lung branching morphogenesisby specifically reducing Smad1 and Smad5 proteins［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2004，286（2）：L293-300.

［53］ Murakami K，Mathew R，Huang J，et al.Smurf1 ubiquitin ligase causes downregulation of BMP receptors and is induced in monocrotaline and hypoxia models of pulmonary arterial hypertension ［J］.Experimental Biology and Medicine，2010，235：805-813.

［54］ Zhu H，Kavsak P，Abdollah S，et al.A SMAD ubiquitin ligase targets the BMP pathway and affects embryonic pattern formation［J］.Nature，1999，400（6745）：687-693.

［55］ Fan G，Xiao L，Cheng L，et al.Targeted disruption of NDST-1 gene leads to pulmonary hypoplasia and neonatal respiratory distress in mice ［J］.FEBS Lett，2000，467（1）：7-11.

［56］ Ringvall M，Ledin J，Holmborn K，et al.Defective heparan sulfate biosynthesis and neonatal lethality in mice lacking N-deacetylase/N-sulfotransferase-1［J］.J Biol Chem，2000，275（34）：25926-25930.

［57］ Hu Z，Wang C，Xiao Y，et al.NDST1-dependent heparan sulfate regulates BMP signaling and internalization in lung development［J］.J Cell Sci，2009，122（Pt 8）：1145-1154.