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    氮、磷、鉀對春季桑葉1-脫氧野尻霉素含量和產量的影響

    2012-12-24 00:53:32佟萬紅黃蓋群鄭繼川夏慶友
    草業(yè)科學 2012年2期
    關鍵詞:嫩芽生物堿桑樹

    劉 剛,殷 浩,佟萬紅,黃蓋群,王 麗,危 玲,鄭繼川,夏慶友

    (1.西南大學蠶學與系統(tǒng)生物學研究所,重慶400716;2.四川省農業(yè)科學院蠶業(yè)研究所,四川 南充637000;3.四川省林業(yè)科學院,四川 成都610066;4.四川省蠶業(yè)科技開發(fā)總公司,四川 南充637000)

    1-脫氧野尻霉素(1-deoxynojimycin,DNJ)是一種哌啶類生物堿,一種高效的α-糖苷酶抑制劑,具有顯著降血糖的功效[1-3]。而目前所知的天然植物中,桑樹(Morusalba)中 DNJ含量最高[4],而且桑樹的主要產物——桑葉,其DNJ含量約為0.1%,是降血糖天然藥物開發(fā)的優(yōu)質原料。大量學者[5-12]對桑葉中的DNJ進行了廣泛的研究,但大多僅限于其含量,而作為植物生長及代謝的重要因素——肥料卻少見相關報道,尤其是配方施肥對桑葉DNJ含量及其總產量的影響,迄今尚未見相關報道。

    基于此,本試驗初步探討了“3414”配方施肥對桑葉DNJ含量和產量的影響,并擬合肥料效應函數,獲得推薦施肥參數,以期為建設DNJ高產優(yōu)質桑園提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑、儀器和DNJ的測定方法

    1.1.1 試劑 1-deoxynojirimycin-HCl(DNJ-HCl)為Sigma公司產品;9-Fluorenylmethyl chlorofor-mate(FMOC-Cl)為Fluca公司產品;乙腈色譜純?yōu)樘旖蚴袆P通化學試劑有限公司出品;其他試劑皆為分析純;試驗用水為自制雙蒸水。

    1.1.2 儀器 Dionex 500E型高效液相色譜儀為美國Dionex公司產品,色譜柱為科瑞Venus-C18-5u,檢測器為UVD170U紫外檢測器,分析軟件為Dionex chromeleox工作站;TGL-16G臺式離心機為江蘇鎮(zhèn)江市科密儀器儀表有限公司產品,KQ-600型超聲波清洗器為深圳市艾斯達工業(yè)自動化有限公司產品,電子恒溫水浴鍋為上海普渡生化科技有限公司產品,旋渦混合器為合肥艾本森科學儀器有限公司產品。

    1.1.3 DNJ的測定方法 參照Kim等[12]的方法的基本原理,按照Yin等[13]描述的方法測定。

    測試樣品的提?。悍Q取待測桑葉粉30mg,加入1mL 0.05mol·L-1HCl,渦流1min,超聲波處理40min,12 000r·min-1離心30min,收集上清液,沉淀物再按上步重復抽提1次,合并2次上清液,定容至2mL,即得樣品提取液。

    DNJ的衍生化:取桑葉粉提取液140μL于1.5 mL的離心管,加入0.4mol·L-1硼酸鉀緩沖液(pH 值8.5)169μL,再加入5mmol·L-1的衍生化試劑FMOC-Cl(溶解于50%乙腈中)250μL,混勻,25℃恒溫水浴中反應20min,加入1mol·L-1甘氨酸(Gly)25μL和剩余的FMOC-Cl以終止反應,再加體積分數為1%的醋酸溶液66μL,用水定容至707μL,最后用孔徑0.2μm尼龍膜過濾,收集濾液,即得測試液。

    測定方法:采用RP-HPLC法測定,色譜柱為科瑞Venus-C18-5u,檢測器為UVD170U紫外檢測器,檢測波長254nm,流動相為乙腈∶0.1%醋酸(V∶V)=11∶16,流速為1.0mL·min-1,進樣量20μL。分析軟件為Dionex chromeleox工作站,外標法分析計算。所有樣品均測定3次,平均值為其DNJ含量。

    1.2 試驗點基本概況 試驗于2010年在四川省農業(yè)科學院蠶業(yè)研究所瀠溪科研試驗桑園進行,該試驗地土壤類型為紫色土。2月測定0~20cm的土壤肥力為:有機質含量3.31%,全氮含量0.16%,有效磷含量11.76mg·kg-1,速效鉀含量164.16 mg·kg-1,土壤pH值為7.72。試驗桑園栽植桑樹品種為川826,樹齡6年。桑樹栽植株行距0.66m×1.33m,種植密度為11 400株·hm-2,每個小區(qū)均設置隔離帶。1月上旬修枝整形,每株8根枝條,其他田間管理與常規(guī)管理相同。

    1.3 試驗設計 采用現代肥料二次回歸“3414”試驗設計,在試驗設計中對氮、磷、鉀3因素4水平14個處理(表1),隨機排列。設計中4個水平的含義:0水平為不施肥,2水平為當地推薦施肥量,1水平=2水平×0.5,3水平=2水平×1.5(該水平為過量施肥水平)。每種處理設3個試驗小區(qū),小區(qū)面積為30m2。在有機肥6 000kg·hm-2的基礎上布置各施肥處理,肥料采用尿素(N 46%)、過磷酸鈣(P2O512%)、氯化鉀 (K2O 60%),在2月下旬施肥。

    1.4 調查方法

    1.4.1 肥料對桑樹不同部位葉DNJ含量的影響2 010年5月20日,查看并標記正常發(fā)育、樹形較好的桑樹。每個小區(qū)選擇6棵桑樹,每棵桑樹選擇2條典型桑枝。6月10日在相同部位分別采摘2片嫩芽、嫩葉、成熟葉、老葉,每個處理的每個小區(qū)的各部位葉分別混合,60℃烘干后,研磨過200目篩,測定各處理桑樹不同部位葉的DNJ含量。

    表1 “3414”施肥設計方案Tabe 1 Details of“3414”fertilizer experiment design

    1.4.2 肥料對桑葉DNJ產量的影響 每個處理實收測產調查,收集每個處理所有的桑葉,60℃烘干后推算每公頃桑樹的干桑葉產量。將每個處理烘干的桑葉混合均勻,研磨過200目篩,測定每個處理桑葉的DNJ平均含量。

    干桑葉產量(kg·hm-2)=平均單株干桑葉質量(kg·hm-2)×11 250(株·hm-2);

    桑葉DNJ產量(kg·hm-2)=桑葉干物質量(kg·hm-2)×桑葉DNJ的平均含量(%)。

    1.5 數據分析 采用SPSS 13.0和SAS 9.0進行統(tǒng)計分析。

    2 結果與分析

    2.1 施肥量對桑葉中DNJ含量的影響

    2.1.1 施氮量對桑葉中DNJ含量的影響 選取P2K2相同水平不同 N 水平(N0=0、N1=120 kg·hm-2、N2=240kg· hm-2、N3=360 kg·hm-2),探討施氮量對桑葉中DNJ含量的影響(圖1)。結果表明,在同一處理中春季上位葉DNJ含量明顯高于下位葉:嫩芽>嫩葉>成熟葉>老葉;桑葉中DNJ含量隨著施氮量的增加而顯著增高,在N2水平時,嫩芽、嫩葉、成熟葉和老葉DNJ含量達到最大,分別為0.398 8%、0.349 6%、0.246 2%和0.167 1%,隨著施氮量的進一步增加,即N3水平,桑葉中DNJ含量顯著降低,但仍顯著高于N1水平。

    圖1 施氮量對桑葉DNJ含量的影響Fig.1 Effects of nitrogen rate on the DNJ content of mulberry leaf

    2.1.2 施磷量對桑葉DNJ含量的影響 選取N2K2相同水平不同P水平(P0=0、P1=42kg·hm-2、P2=84kg·hm-2、P3=126kg·hm-2),探討施磷量對桑葉中DNJ含量的影響(圖2)。結果表明,在同一處理中春季上位葉DNJ含量明顯高于下位葉:嫩芽>嫩葉>成熟葉>老葉。嫩芽和嫩葉中DNJ含量變化趨勢相同,P2和P3、P0和P1相互之間桑葉中DNJ含量均沒有顯著差異,但前者DNJ含量顯著高于后者,嫩芽和嫩葉中DNJ最高含量分別為0.398 8%和0.349 6%。磷肥對春季成熟葉中DNJ含量影響較大,隨著施磷量的增加,成熟葉中DNJ含量也顯著增加,在P2水平時達到最大值,為0.246 2%,P3水平時又顯著降低,但仍顯著高于P1水平。隨著施磷量的增加,春季老葉中DNJ含量也顯著增加,在P2水平時達到最大值,0.167 1%,P3與P2之間沒有顯著差異。

    2.1.3 施鉀量對桑葉中DNJ含量的影響 選取N2P2相同水平不同 K 水平 (K0=0、K1=60 kg·hm-2、K2= 120kg· hm-2、K3= 180 kg·hm-2),探討施鉀量對桑葉中DNJ含量的影響(圖3)。結果表明,在同一處理中,春季上位葉中DNJ含量大于下位葉:嫩芽>嫩葉>成熟葉>老葉。嫩芽中DNJ含量在K0、K1和K3水平上均沒有顯著差異,但均顯著低于K2水平的嫩芽中DNJ含量(0.398 8%);嫩葉、成熟葉和老葉中DNJ含量隨著施鉀量的增加表現相同的變化:K2和K3、K0和K1相互之間均沒有顯著變化,但前者顯著高于后者,DNJ含量最大值分別為0.349 6%、0.246 2%、0.167 1%。

    2.2 桑葉平衡施肥設計肥料效應模型的配置采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件,利用當年的肥料和DNJ價格[N(4.1元·kg-1)、P2O5(3.2元·kg-1)、K2O(5.0元·kg-1)、DNJ(2×108元·kg-1)]以及桑葉DNJ產量(表2),建立以桑葉總DNJ產量為函數及氮、磷、鉀為因子的肥料效應函數,求算出最佳施肥量及最佳產量。

    圖2 施磷量對桑葉DNJ含量的影響Fig.2 Effects of phosphorus rate on the DNJ content of mu1berry leaf

    圖3 施鉀量對桑葉DNJ含量的影響Fig.3 Effects of potassium rate on the DNJ content of mu1berry leaf

    表2 施肥水平對桑葉DNJ產量的影響Table 2 Effects of fertilazation level on the DNJ content of mulberry

    2.2.1 三元二次肥料效應函數 桑葉三元二次肥料效應函數:

    由全因子模型求出最佳施肥量及最佳產量,即:桑葉中總DNJ最佳經濟產量為23.23kg·hm-2,推薦施肥指標為N 286.11kg·hm-2、P2O 595.22 kg·hm-2、K2O 159.62kg·hm-2。

    2.2.2 多種肥料效應函數的施肥決策信息 四川大部分地區(qū)都存在過量施肥的情況。本試驗對照地參照當地常規(guī)施用量施肥,其中N 400kg·hm-2;P2O5200kg·hm-2,K2O 200kg·hm-2,其肥料總投入為3 280.00元·hm-2,DNJ產量為18.59 kg·hm-2;而推薦的施肥方案肥料總投入為2 275.85元·hm-2,肥料投入降低了30.61%,而其DNJ產量為23.23kg·hm-2,增加了24.96%。

    3 討論

    氮、磷、鉀是植物生長的3種基本要素,但不同的植物對其需要量及其比例是不同的,不同肥力水平的土壤,施用肥料的最佳用量差別很大,尤其是藥用植物,對其精準施肥的研究不僅要追求其含量和產量,還要注重次生代謝產物的產量。

    張燕等[14]報道,單施氮肥對益母草(Leonurus artemisia)中水蘇堿和總生物堿產量有很大的促進作用,足量的磷元素與氮元素合理配施可以提高氮的肥效。紀瑛等[15]研究表明,施用氮肥能顯著提高苦參(Sophoraflavescens)中總生物堿的含量和產量,但過量施用則呈降低趨勢。陳泉和李建國[16]報道,施肥并不能顯著影響植物生物堿的含量,只是顯著提高植物干物質產量,從而增加了生物堿產量。其他相關研究[17-19]結果也證明,氮對植物體內生物堿含量具有提高和促進效應。

    肥料對桑葉中DNJ的含量和產量的影響的相關研究報道較少。Yin等[10]報道了不同氮素形態(tài)及其配比均能顯著影響桑葉中DNJ含量。而本研究結果表明,氮、磷、鉀單因素均能顯著影響春季桑葉中DNJ的含量,不同氮、磷、鉀施入量及其配比能顯著影響春季桑葉DNJ產量。氮素是DNJ合成的必需元素,所以施氮量對其含量和產量的影響較大,而磷、鉀元素可能直接或間接影響DNJ的合成[20];過量施肥,桑葉DNJ含量不會提高,甚至會顯著降低,這可能是破壞了土壤環(huán)境的養(yǎng)分平衡或DNJ含量達到一定水平后表現的飽和反應。

    本研究利用肥料效應函數得到桑葉DNJ的最佳產量及其最佳施肥指標,為以桑葉為主要原料,并以DNJ為主要成分的產品開發(fā),提供獲得高產優(yōu)質原料的施肥方法,為解決人工栽培中存在的藥材質量不穩(wěn)定等問題提供參考。

    植物次生代謝產物的合成過程較為復雜,生物因素和非生物因素均能顯著影響其含量[21],所以對其仍需系統(tǒng)的研究,尤其是影響DNJ生物合成的具體機制需要進一步研究探討。

    4 結論

    氮、磷、鉀的施肥水平能顯著影響桑葉中的DNJ含量。在單因素水平時,隨著施肥量的增加,桑葉中DNJ含量也隨之顯著增加,在N2P2K2水平時達到最大,再增施肥料,其含量基本沒有變化或者顯著降低,所以科學施肥能顯著提高桑葉的DNJ產量。通過建立肥料效應函數,得到桑葉的推薦施肥指標和DNJ最佳經濟產量:桑葉中總DNJ最佳經濟產量為23.23kg·hm-2,推薦施肥指標為N 286.11kg·hm-2、P2O 595.22kg·hm-2、K2O 159.62kg·hm-2。

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