免疫層析試紙條監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)感染日本血吸蟲(chóng)病牛治療前后抗體消長(zhǎng)

付 媛，盧福莊，楊玉煥，俞國(guó)喬，顧 昀，馮尚連，石團(tuán)員，賈會(huì)娟，張雪娟

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021;2.東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;3.浙江省畜牧獸醫(yī)局，浙江 杭州 310020;4.河北省新樂(lè)市農(nóng)業(yè)畜牧局，河北 新樂(lè) 050700)

血吸蟲(chóng)病是一種人獸共患的寄生蟲(chóng)病，它寄生于人、牛、羊、豬、犬，及一些野生哺乳動(dòng)物的腸系膜靜脈和門(mén)靜脈系統(tǒng)的血管內(nèi)，嚴(yán)重威脅著疫區(qū)人畜健康和生命安全，給畜牧業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，被世界衛(wèi)生組織列為全球重點(diǎn)防治疾病之一。牛是血吸蟲(chóng)的主要保蟲(chóng)宿主，牛血吸蟲(chóng)感染率的高低在一定程度上決定該地區(qū)血吸蟲(chóng)病的流行程度。

牛血吸蟲(chóng)病抗體檢測(cè)試紙條具有成本低廉，操作簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)，為普查血吸蟲(chóng)病牛，篩選化療目標(biāo)群體提供技術(shù)手段，是低成本有效控制牛血吸蟲(chóng)病疫情的重要環(huán)節(jié)［1］。采用該法對(duì)實(shí)驗(yàn)感染牛血吸蟲(chóng)病血清抗體進(jìn)行監(jiān)測(cè)是闡明該試紙條是否具有早期診斷價(jià)值和療效參考價(jià)值的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試動(dòng)物

黃牛5頭 (1～5號(hào))，1歲半，購(gòu)自湖北鐘祥血吸蟲(chóng)非疫區(qū)。牛經(jīng)病原學(xué)和血清學(xué)檢查均無(wú)血吸蟲(chóng)感染。

1.1.2 血吸蟲(chóng)尾蚴

購(gòu)自湖南岳陽(yáng)血防站的陽(yáng)性釘螺所釋放。每頭牛感染1 000～1 500條。

1.1.3 治療實(shí)驗(yàn)感染血吸蟲(chóng)病牛藥品

治療藥品為獸用吡喹酮，系南京制藥廠產(chǎn)品，批號(hào)為20060501。

1.1.4 牛血吸蟲(chóng)病抗體檢測(cè)試紙條

為浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院和浙江省畜牧獸醫(yī)局共同研制，批號(hào)為20101107。

1.2 方法

1.2.1 血清制備

在實(shí)驗(yàn)感染血吸蟲(chóng)尾蚴前，牛頸靜脈采血，制備的血清作為0周血清。牛從感染后第1周至第10周，每周采血1次，分離血清，-20℃保存。牛感染后第11周用吡喹酮進(jìn)行治療，治療后第1～3周每周采血1次，治療后第4～24周，每2周采血1次，分離血清，-20℃保存。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)感染血吸蟲(chóng)牛用吡喹酮治療

5頭牛于實(shí)驗(yàn)感染血吸蟲(chóng)后第11周時(shí)，用吡喹酮按60 mg·kg-1的劑量進(jìn)行治療，每隔7 d治療1次，共治療3次。

1.2.3 血清稀釋

取潔凈1.5 mL離心管，編上對(duì)應(yīng)的血清號(hào)碼，吸取血清稀釋液0.05 mL加到塑料離心管中，吸取血清0.05 mL，加入對(duì)應(yīng)編號(hào)的塑料離心管中混勻后，即成2倍稀釋的血清。

1.2.4 牛感染血吸蟲(chóng)前后及治療前后血清抗體檢測(cè)方法

取試紙條平放在桌面上，吸取2倍稀釋的血清0.05 mL，滴在試紙條標(biāo)有箭頭前端的樣品墊上。

試紙條結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。陽(yáng)性。檢測(cè)線 (T)與質(zhì)控線 (C)均出現(xiàn)清晰紅色條帶。血清中的抗體水平越高，T線顏色越深，根據(jù)T線顏色深淺可判為呈現(xiàn)濃郁的紅色條帶為強(qiáng)陽(yáng)性，以+++表示，呈現(xiàn)清晰可見(jiàn)的紅色條帶，為陽(yáng)性，以++表示，呈現(xiàn)淺紅色條帶為弱陽(yáng)性，以+表示。

陰性。只有C線出現(xiàn)清晰可見(jiàn)紅色條帶，以-表示。

可疑。C線出現(xiàn)一條顏色清晰可見(jiàn)的紅色線，而T線出現(xiàn)一條顏色很淺，若隱若顯的紅色帶，以±表示。

無(wú)效。若檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)血清T、C線不出現(xiàn)紅色條帶或陰性標(biāo)準(zhǔn)血清C線不出現(xiàn)紅色條帶，則該試紙條為無(wú)效。

2 結(jié)果和分析

用試紙條檢測(cè)5頭實(shí)驗(yàn)感染血吸蟲(chóng)后第0～10周和治療后第1～24周的牛血清中的抗體，結(jié)果從血吸蟲(chóng)感染后第4～5周開(kāi)始，采集的牛血清中檢測(cè)到了抗體，在感染后第8～10周及治療后第1～4周時(shí)，抗體水平達(dá)高峰，然后從治療后第6周開(kāi)始，抗體逐漸下降，1，2，3，4和5號(hào)牛依次在治療后第 24，16，22，20和 20周抗體轉(zhuǎn)陰(表1)。

3 小結(jié)和討論

用牛血吸蟲(chóng)病抗體檢測(cè)試紙條檢測(cè)實(shí)驗(yàn)感染血吸蟲(chóng)治療前后血清抗體，其中有2頭牛在實(shí)驗(yàn)感染血吸蟲(chóng)第4周檢測(cè)出抗體;在感染后第5周，5頭牛都檢測(cè)出血清抗體，表明該試紙條具有早期診斷的價(jià)值。在感染后第8～10周及治療后第1～4周時(shí)，抗體水平達(dá)高峰，然后從治療后第6周開(kāi)始，抗體逐漸下降，說(shuō)明該試紙條具有療效考核的價(jià)值。1，2，3，4和 5號(hào)牛依次在治療后 24，16，22，20和20周抗體轉(zhuǎn)陰，不同牛的抗體水平不一致可能與牛的個(gè)體差異相關(guān)。牛血吸蟲(chóng)病抗體檢測(cè)試紙條具有早期診斷與療效考核價(jià)值。

用試紙條法與以免疫滲濾方法［2］和血吸蟲(chóng)重組融合蛋白 (rLHD-Sj23-GST)間接 ELISA法［3］檢測(cè)人工感染牛血吸蟲(chóng)抗體相比，本試紙條方法的早期診斷時(shí)間介于兩者之間，免疫滲濾法最早可以檢測(cè)到感染2周的牛血吸蟲(chóng)抗體 (1/5)，而試紙條法最早可以檢測(cè)感染4～5周的牛血吸蟲(chóng)抗體 (2/5)，重組融合蛋白 (rLHD-Sj23-GST)間接 ELISA法在感染后5～8周抗體顯陽(yáng)性 (2/5)。3種方法在抗體的高峰期出現(xiàn)的時(shí)間上差別不大。在抗體的轉(zhuǎn)陰階段，試紙條法檢測(cè)5頭牛感染血吸蟲(chóng)治療后第16～24周抗體轉(zhuǎn)陰;免疫滲濾法檢測(cè)3頭牛感染血吸蟲(chóng)治療后第29～39周抗體轉(zhuǎn)陰，重組融合蛋白 (rLHD-Sj23-GST)間接ELISA法檢測(cè)5頭牛感染血吸蟲(chóng)治療后第8～24周抗體轉(zhuǎn)陰。由此可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)感染血吸蟲(chóng)病牛血清中可檢測(cè)到的抗體陽(yáng)性時(shí)間似與檢測(cè)方法的靈敏度相關(guān)。檢測(cè)方法的靈敏度高，可檢測(cè)到抗體陽(yáng)性的時(shí)間較早，而在牛得到有效治療后抗體轉(zhuǎn)陰的時(shí)間則較遲;相反，檢測(cè)方法的靈敏度低，可檢測(cè)到抗體陽(yáng)性的時(shí)間較遲，而在牛得到有效治療后抗體轉(zhuǎn)陰的時(shí)間則較早。

表1 用試紙條檢測(cè)實(shí)驗(yàn)感染血吸蟲(chóng)牛治療前后抗體消長(zhǎng)情況

［1］ 盧福莊，付媛，趙俊龍，等.實(shí)驗(yàn)感染血吸蟲(chóng)牛、兔抗體的消長(zhǎng)規(guī)律 ［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，21(4):316-320.

［2］ 李友，趙俊龍.牛血吸蟲(chóng)病分子ELISA診斷方法的建立和應(yīng)用 ［D］.武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.