苦參堿對(duì)肺纖維化大鼠核因子E2相關(guān)因子2、血紅素氧合酶-1的作用研究影響

羅慶凱 陳 偉 何振華▲ 張秀峰 李熾觀 郭春芳

1.湖南省郴州市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖南郴州 423000；2.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖南衡陽(yáng) 421001；3.中南大學(xué)衛(wèi)生部肝膽腸外科研究中心，湖南長(zhǎng)沙 410008

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是特發(fā)性肺纖維化、結(jié)節(jié)病、塵肺、過(guò)敏性肺炎、藥物和放射導(dǎo)致的纖維化以及膠原血管病致纖維化肺泡炎等慢性肺部疾病的終末病理過(guò)程。在肺纖維化的形成機(jī)制中，氧化應(yīng)激的作用機(jī)制成為主流，指氧化與抗氧化的失平衡狀態(tài)。氧化應(yīng)激促進(jìn)TNF-α、IL-1、IL-8等前炎性介質(zhì)表達(dá)的同時(shí)，提高具有保護(hù)性的γ-GCS、MnSOD、GST等[1]抗氧化基因的表達(dá)。核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）屬于Cap-n Collar家族，它在抗氧化劑應(yīng)激元件（ARE）介導(dǎo)的抗氧化基因表達(dá)中起重要的作用。血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1），谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶族（glutathione S-transferases，GSTs）和NAD（P）H醌氧化還原酶1[NAD（P）H quinoneoxidoreductase1，NQO1]是基Ⅱ相酶主要組成部分。HO-1是催化血紅素生成CO、膽紅素及鐵離子的限速酶，其保護(hù)作用通過(guò)其催化血紅素分解的三種產(chǎn)物進(jìn)行。HO-1的保護(hù)作用還可能與降低Caspase-3活性以對(duì)抗細(xì)胞凋亡和抑制TNF-α水平有關(guān)[2]。前期研究已經(jīng)表明，Nrf2在COPD和哮喘肺中抗氧化應(yīng)激中處于核心地位[2-3]。但是，Nrf2及其下游調(diào)控的HO-1在大鼠肺纖維化表達(dá)還有待于進(jìn)一步研究。

苦參堿（Matrine）為豆科槐屬植物中生物堿的主要成分，屬四環(huán)的喹諾里西啶生物。近年來(lái)苦參堿的藥理和臨床研究中，抗成纖維細(xì)胞增殖作用研究較多：①能降低肝纖維化指標(biāo)透明質(zhì)酸（HA）、Ⅳ型膠原（Ⅳ-C）、前Ⅲ型膠原（PCⅢ）、層黏連蛋白（LN）[4]。②抑制膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的合成，延緩腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維模型大鼠的病理進(jìn)程。③對(duì)兔耳腹側(cè)面增生性瘢痕有明顯的治療作用[5]。④苦參堿能抑制血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）[6]誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖。本文通過(guò)博來(lái)霉素（BLM）誘導(dǎo)建立大鼠肺纖維化經(jīng)典模型，探討Nrf2、HO-1在肺纖維化中的表達(dá)，苦參堿對(duì)肺纖維化的作用及Nrf2、HO-1表達(dá)的影響，為臨床肺纖維化防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

苦參堿干粉（吉林玉皇藥業(yè)有限公司）；博來(lái)霉素15 mg/支（日本化藥株式會(huì)社）；醋酸潑尼松（天津力生制藥股份有限公司）；總RNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）；2×PCR試劑DNA MARKER 100 bp（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；RT試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；Nrf2抗體即用型3ML（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；5×TBE EB溶液（北京索萊寶生物技術(shù)有限公司）；DEPC TRIS（進(jìn)口原裝，AMERSCO）；瓊脂糖（西班牙原裝）；SP免疫組化試劑盒，Nrf2、HO-1多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；引物設(shè)計(jì)：Nrf2、HO-1、β-actin（上海生物技術(shù)有限公司）；引物產(chǎn)品合成：Nrf2、HO-1、β-actin（上海生物技術(shù)有限公司），其余試劑自配。

1.2 主要儀器

ZT-12K生物組織自動(dòng)脫水機(jī)（湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)研所）、顯微鏡（杭州光學(xué)儀器廠）、輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（德國(guó)萊卡公司）、BMJ-3型病理組織包埋機(jī)（常州中威電子儀器廠）、PHY-型組織漂烘機(jī)（常州中威電子儀器廠）、高壓蒸汽消毒柜（SANYO公司）、光學(xué)顯微鏡和光學(xué)照像系統(tǒng)（日本OLYPUS公司）、倒置顯微鏡（日本OlYPUS公司）、震蕩混合儀（德國(guó)萊卡公司）、恒溫烤箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)SIGMA公司）、luzex-F圖像分析儀（日本）、RNA濃度測(cè)定儀PCR儀（德國(guó)Eppendorf公司）；軟NIKON&Spot彩色病理圖文分析系統(tǒng)（重慶天海公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及處理

成年健康雄性SD大鼠120只，隨機(jī)分為五組，分別為正常對(duì)照組（C）、模型組（M）、潑尼松處理組（P）、苦參堿50處理組（M50）、苦參堿100處理組（M100），每組24只。M、P、M50、M100均一次性給予博來(lái)霉素（5 mg/kg）進(jìn)行肺纖維化造模，C組注入等體積的生理鹽水。自氣管內(nèi)灌注博來(lái)霉素后第1天起，M組和C組每天以1%羧甲基纖維素鈉10 mL/kg灌胃1次，M50、M100組分別每天以50、100 mg/kg苦參堿羧甲基纖維素鈉溶液灌胃1次，P組以5 mg/kg潑尼松生理鹽水每日灌胃1次，至第28天。造模后第7、14、28天將大鼠處死，每組8只每次。取右肺，液氮保存。取左肺固定，包埋，切片。

1.4 觀察指標(biāo)及方法

采用免疫組化法（SP法）檢測(cè)蛋白表達(dá)，步驟按照北京博奧森生物技術(shù)有限公司說(shuō)明書(shū)操作。用采圖軟NIKON &Spot彩色病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集。細(xì)支氣管、肺泡區(qū)，各隨機(jī)取3個(gè)視野作圖象分析。luzex-F圖像分析儀分析，作A值測(cè)定（即陽(yáng)性信號(hào)與所選擇總面積之比值），A值越大，表達(dá)水平越高。

采用RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)，步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。引物及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1。結(jié)果用UVP凝膠圖像掃描系統(tǒng)掃描，Quantity One軟件分析，算出各電泳條帶的面積積分灰度值，并將Nrf2、HO-1表達(dá)量進(jìn)行線性相關(guān)分析。

表1 各基因引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，重復(fù)測(cè)量的計(jì)量資料采用方差分析，兩兩比較采用SNK法，相關(guān)關(guān)系分析用Pearson積差相關(guān)系數(shù)表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理觀察

C組大鼠肺泡無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，結(jié)構(gòu)正常。M組第7天為肺泡腔、肺間質(zhì)內(nèi)有大量的多核及單核細(xì)胞浸潤(rùn)，炎性肉芽組織破壞了正常結(jié)構(gòu)。第14天時(shí)，膠原沉積，斑片狀纖維化；第28天肺泡炎癥稍有減輕，但病變范圍彌散，肺泡結(jié)構(gòu)破壞。M50組、M100組、P組與M組病理變化規(guī)律相似，但程度都較M組輕微。

2.2 大鼠肺組織蛋白表達(dá)

大鼠肺組織Nrf2、HO-1表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖1、2。定量分析顯示在M、P、M50、M100組造模后的幾次取材中，Nrf2、HO-1表達(dá)均高于C組（P＜0.05）。第7、14天P組、M50組、M100組的Nrf2、HO-1表達(dá)比M組高（P＜0.05）；P組與M50組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；第28天Nrf2、HO-1表達(dá)在M、P、M50、M100組明顯低于第7天（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠肺組織Nrf2蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化

2.3 大鼠肺組織勻漿mRNA表達(dá)

M、P、M50、M100組造模后Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)均顯著強(qiáng)于C組（P＜0.05）。第7、14天時(shí)P組、M50組、M100組表達(dá)強(qiáng)于M組（P＜0.05）；M100組表達(dá)量高于P、M50組（P＜0.05）。第28天時(shí)M組、P組、M50組、M100組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；但較第7天表達(dá)顯著變?nèi)酰≒＜0.05）。見(jiàn)表2、3。

圖2 各組大鼠肺組織HO-1蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化

表2 各組大鼠肺組織Nrf2mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化（±s）

表2 各組大鼠肺組織Nrf2mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與潑尼松處理組比較，cP＜0.05；與苦參堿100處理組比較，dP＜0.05；與本組第7天比較，eP＜0.05

組別 第7天 第14天 第28天正常對(duì)照組（C）模型組（M）潑尼松處理組（P）苦參堿50處理組（M50）苦參堿100處理組（M100）1.212±0.403 1.601±0.213a 1.510±0.405abd 1.404±0.321abd 1.821±0.411abc 1.403±0.321 1.005±0.403a 1.313±0.414abd 1.320±0.201abd 1.412±0.502abc 1.215±0.205 0.807±0.443ae 0.932±0.306abde 0.819±0.422abde 0.954±0.403abce

表3 各組大鼠肺組織HO-1mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化（±s）

表3 各組大鼠肺組織HO-1mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與潑尼松處理組比較，cP＜0.05；與苦參堿100處理組比較，dP＜0.05；與本組第7天比較，eP＜0.05

組別 第7天 第14天 第28天正常對(duì)照組（C）模型組（M）潑尼松處理組（P）苦參堿50處理組（M50）苦參堿100處理組（M100）0.425±0.035 0.601±0.051a 1.083±0.058abd 1.004±0.321abd 1.234±0.073abc 0.372±0.028 0.585±0.042a 0.821±0.059abd 0.815±0.201abd 0.995±0.060abc 0.285±0.031 0.591±0.045ae 0.772±0.056abde 0.752±0.422abde 0.781±0.072abce

經(jīng)直線相關(guān)分析，結(jié)果顯示Nrf2蛋白/mRNA表達(dá)與HO-1蛋白/mRNA表達(dá)均呈正相關(guān)（P＜0.05）。

3 討論

3.1 大鼠肺纖維化動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)

博來(lái)霉素是一組多肽類抗腫瘤抗生素，可引起肺纖維化，其公認(rèn)機(jī)制為在氧分子和亞鐵離子存在下，博來(lái)霉素產(chǎn)生活性氧（ROS），引起肺纖維化，目前已用作研究肺纖維化的經(jīng)典模型[7]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果HE染色示模型組第28天大量肺泡結(jié)構(gòu)萎陷，肺泡間隔及部分肺泡腔被膠原和纖維蛋白占據(jù)，證明肺纖維化造模成功。

3.2 大鼠肺組織中Nrf2、HO-1基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化

Nrf2在抗氧化劑應(yīng)激元件（ARE）介導(dǎo)的抗氧化基因表達(dá)中起重要的作用，在細(xì)胞氧化應(yīng)激時(shí)，Nrf2可能進(jìn)入細(xì)胞核與ARE結(jié)合，導(dǎo)致下游GSTs、谷氨酸-半胱氨酸連接酶、HO-1和硫氧還蛋白基因的轉(zhuǎn)錄活化。HO-1為一種熱休克蛋白，為誘導(dǎo)型血紅素氧合酶，對(duì)大鼠肺組織纖維化有保護(hù)性作用[8]，其機(jī)制是多種因素容易將HO-1時(shí)HO的誘導(dǎo)形式影響，誘導(dǎo)肺HO-1 mRNA的轉(zhuǎn)錄，引起肺HO-1蛋白合成和活性增加，肺組織HO-1合成增加并釋放，使得外周HO-1活性增強(qiáng)。另外還可能激活了缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1），HO-1基因163-pb片段上的位點(diǎn)與HIF-1結(jié)合，調(diào)節(jié)HO-1mRNA基因轉(zhuǎn)錄[9]；氧化反應(yīng)導(dǎo)致的體內(nèi)氧自由基增多，炎性細(xì)胞因子的分泌增加，酸中毒導(dǎo)致的游離鈣增加均可直接誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)[10]。

本文結(jié)果顯示，博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型中，Nrf2、HO-1在模型組表達(dá)較正常對(duì)照組增高（P＜0.05），且表達(dá)量從第7天后就逐步減低，第28天表達(dá)最低峰，但仍高于正常對(duì)照組。這是由于博來(lái)霉素氣管內(nèi)注入后大鼠肺組織第7天處于炎癥及氧化應(yīng)激高峰期，機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)Nrf2的表達(dá)，產(chǎn)生下游HO-1等抗氧化物質(zhì)來(lái)對(duì)抗炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)機(jī)體免受損傷。在28天時(shí)，肺纖維化已經(jīng)基本形成，氧化應(yīng)激因素已經(jīng)比較輕，因此表達(dá)最低。干預(yù)組與模型組變化趨勢(shì)一致，但Nrf2、HO-1表達(dá)顯著高于模型組和正常對(duì)照組。這表明通過(guò)提高抗氧化轉(zhuǎn)錄因子Nrf2及其靶基因之一的HO-1表達(dá)可以保護(hù)肺組織，減輕肺纖維化程度。而模型組中抗氧化基因Nrf2及HO-1表達(dá)增加，卻仍然無(wú)法阻止肺纖維化的進(jìn)展，考慮可能因素肺纖維化形成過(guò)程早期主要是啟動(dòng)炎癥及免疫反應(yīng)，同時(shí)啟動(dòng)了氧化應(yīng)激反應(yīng)，使機(jī)體處于氧化和抗氧化失平衡狀態(tài)。

3.3 苦參堿對(duì)大鼠肺纖維化的干預(yù)作用

本文結(jié)果顯示苦參堿[100 mg/（kg·d）]能顯著減輕大鼠肺組織肺泡炎的程度，但仍較正常對(duì)照組重。苦參堿有一定的抗炎作用，但低劑量[50 mg/（kg·d）]苦參堿在減輕肺泡炎程度上與潑尼松處理組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不明顯；苦參堿在劑量較大時(shí)[100 mg/（kg·d）]，其抗炎作用較潑尼松處理組強(qiáng)。推測(cè)苦參堿可能主要通過(guò)抑制炎性細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞等）、減少炎性介質(zhì)的產(chǎn)生來(lái)減輕炎癥程度?？鄥A100處理組肺組織中Nrf2、HO-1表達(dá)明顯較其他組在第7、14天增多，具體機(jī)制可能與氧化應(yīng)激時(shí)抗氧化有關(guān)，如通過(guò)Nrf2的高表達(dá)來(lái)調(diào)控HO-1等下游抗氧化物質(zhì)。潑尼松龍的干預(yù)作用與低劑量苦參堿作用相似，二者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這表明苦參堿100處理組可能是通過(guò)誘導(dǎo)Nrf2的高表達(dá)來(lái)促使下游抗氧化物質(zhì)如HO-1的大量生成，從而在纖維化早期及炎癥期抑制肺纖維化的發(fā)展。

苦參堿有抑制博來(lái)霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化作用，其機(jī)制可能與早期上調(diào)Nrf2、HO-1表達(dá)調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激有關(guān)?？鄥A有望成為臨床治療肺間質(zhì)性疾病的一類新藥。

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