DNMT 在胃癌中的表達及DNMT 抑制劑5－氮雜－2'－脫氧胞苷對胃癌的影響

何 苗， 湯為學， 姜 蓉， 范 晶， 張 能， 查 朗， 王子衛(wèi)△

(重慶醫(yī)科大學1附屬第一醫(yī)院普通外科，2附屬第一醫(yī)院實驗研究中心，3基礎醫(yī)學院，4附屬第一醫(yī)院急診科，重慶400016)

DNA 甲基化轉移酶(DNA methyltransferase，DNMT)是催化DNA 甲基化修飾的生物酶。一般認為DNMT 高表達導致抑癌基因高甲基化并失活是腫瘤發(fā)展的表觀遺傳機制［1］。但也有資料表明DNMT 低表達及癌基因低甲基化并激活亦是腫瘤的重要特點［2－4］;加上既往對DNMT 的研究集中在DNMT1、DNMT3A 和DNMT3B，而對DNMT2 和DNMT3L 探索甚少。本文遂全面分析5 種DNMT 在胃癌與胃黏膜的表達特點，以期對胃癌(腫瘤)表觀遺傳學的研究提供參考。

材 料 和 方 法

1 材料

胃癌與對應癌旁組織(60 對)由重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胃腸外科提供，標本病理診斷明確。SGC－7901、MKN－45(胃癌細胞株)及GES－1(胃黏膜上皮細胞株)由重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院實驗研究中心饋贈。DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B 和DNMT3L 抗體購自Santa Cruz;免疫組化與免疫熒光相關試劑購自中杉金橋;免疫印跡相關材料購自碧云天;噻唑藍(MTT)和5－氮雜－2'－脫氧胞苷(5－aza－2'－deoxycytidine)購自Sigma。其它基本實驗材料購自鼎國昌盛與惠爾利公司。

2 方法

2.1 免疫組織化學 免疫組化法參照中杉金橋公司提供的試劑盒說明書進行。Ⅰ抗孵育采用4 ℃過夜(Ⅰ抗稀釋比為1∶50);顯色時間均為5 min。

2.2 免疫組化結果判斷 根據(jù)細胞著色程度區(qū)分染色(a):0(無染色)，1(淺黃色)，2(黃褐色)，3(褐紅色)。區(qū)分染色細胞占相應細胞總體的比率(b):1(b ＜25%)，2(25% ≤b ＜50%)，3(50% ≤b ＜75%)，4(b≥75%)。再根據(jù)a × b 判斷陽性結果(c):陰性(c=0)，弱陽性(c =1、2)，陽性(c =3、4、6、8)，強陽性(c =9、12)。計算表達率包括弱陽性、陽性和強陽性的資料。

2.3 細胞培養(yǎng) SGC－7901、MKN－45 和GES－1細胞均用加10%胎牛血清的RPMI－1640 培養(yǎng)基培養(yǎng);常規(guī)置于37 ℃、5%CO2孵箱內(nèi)。3 d 傳代或更換培養(yǎng)基1 次。

2.4 免疫熒光 接種細胞株至96 孔板，孵育24 h。將孔板內(nèi)細胞按固定(4%多聚甲醛，室溫20 min)、打孔(0.5%Triton X－100，37 ℃20 min)、封閉(山羊血清封閉液，37 ℃30 min)、Ⅰ抗孵育(1∶50，4 ℃過夜)、熒光Ⅱ抗孵育(1∶50，37 ℃1 h)的順序處理。設立PBS 代替Ⅰ抗的陰性對照。熒光顯微鏡觀察結果。

2.5 Western 免疫印跡 收集細胞，免疫印跡法按參考文獻［5］記錄的方法進行，實驗重復3 次，Quantity One 軟件分析結果。

2.6 噻唑藍比色法 細胞于對數(shù)生長期接種至96孔板，1 ×104cells/well，250 μL 培養(yǎng)基/well。5－氮雜－2'－脫氧胞苷終濃度5 μmol/L、50 μmol/L 和500 μmol/L 處理上述細胞。于1、2、3、4、5 d 加MTT(5 g/L，20 μL/well)，4 h 后棄培養(yǎng)基加二甲亞砜(150 μL/well)，酶標儀490 nm 波長測A 值。設立陰性對照(不加藥)及空白對照(無細胞)組，實驗設復孔5 個。細胞增殖率= (A目的－ A空白)/(A對照－A空白)。

2.7 流式細胞儀檢測 細胞平均接種至2 個培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)24 h。5－氮雜－2'－脫氧胞苷終濃度50 μmol/L處理其中之一，繼續(xù)培養(yǎng)96 h。收集2 瓶細胞，PBS 洗滌2 次，分別加入1 mL 70%乙醇中4 ℃固定過夜。第2 d 送流式細胞儀檢測細胞周期與凋亡率。實驗重復3 次。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件處理。計數(shù)資料用卡方檢驗、Fisher 精確概率檢驗或符號秩檢驗分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，用單因素方差分析比較均數(shù)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 DNMT 在人胎盤組織表達

根據(jù)部分DNMT 抗體說明，取胎盤組織為DNMT 陽性對照標本。5 種DNMT 均在人胎盤組織表達，以DNMT2 顯著，見圖1，提示抗體與免疫組化步驟無誤。

Figure 1. Expression of DNMT2 in human placenta tissue(×400).圖1 DNMT2 在人胎盤組織的表達

2 胃癌與癌旁組織中DNMT 的表達

Figure 2. Expression of DNMT in gastric cancer and corresponding non－cancerous tissues(×400).圖2 DNMT 在人胃癌及癌旁組織的表達

免疫組化法檢測胃癌及癌旁組織DNMT 表達的結果見圖2、3。癌旁組織DNMT1 表達率63. 3%(38/60)，DNMT2 表達率93.3%(56/60)，DNMT3A表達率71.7%(43/60)，DNMT3B表達率93.3%(56/60)，DNMT3L 表達率75.0%(45/60)。胃癌組織DNMT1 表達率11. 7% (7/60)，DNMT2 表達率43.3%(26/60)，DNMT3A 表達率15.0%(9/60)，DNMT3B 表達率85.0%(51/60)，DNMT3L表達率36.7%(22/60)?？梢姵鼶NMT3B 外，其余DNMT 在胃癌的表達率不如癌旁組織(P ＜0. 05)。此外，DNMT1 和DNMT3L 為胞核胞漿共表達，DNMT2 為胞核表達，而DNMT3A 和DNMT3B 為胞漿表達。

3 DNMT 在胃癌與癌旁組織的配對比較

胃癌與自身癌旁組織配對，60 對組織的DNMT表達差異見圖4。其中癌旁組織表達低于胃癌組織記為“－”(如癌旁為陽性，癌為強陽性);癌旁組織表達高于胃癌組織記為“+”(如癌旁為陽性，癌為弱陽性);兩者表達無差異記為“0”(如兩者均為陽性)。運用符號秩檢驗分析5 種DNMT 在胃癌及癌旁組織的差異，發(fā)現(xiàn)DNMT1 和DNMT3A 在胃癌表達顯著低于癌旁組織(P ＜0.01);DNMT2 和DNMT3L 在胃癌表達低于癌旁組織(P ＜0.05);DNMT3B 在胃癌及癌旁中表達無顯著差異(P ＞0.05)。與結果2 相符合。

4 DNMT 與胃癌臨床特征的關聯(lián)

卡方檢驗及Fisher 精確概率檢驗分析DNMT 與胃癌臨床特征的關聯(lián)，結果見表1。DNMT2 表達與胃癌分化及臨床分期相關(P ＜0.05);DNMT3A 表達與胃癌臨床分期相關(P ＜0.05)。而其余DNMT 與性別、年齡、腫瘤大小、幽門螺旋桿菌感染等臨床特征無顯著關聯(lián)(P≥0.05)。

5 胃癌與胃上皮細胞株中DNMT 的定位

免疫熒光法研究DNMT 在胃癌與胃上皮細胞中的定位發(fā)現(xiàn)，DNMT2 在胞核表達顯著，見圖5A;DNMT3B 和DNMT3L 在胞漿表達，見圖5B;而DNMT1與DNMT3A 特異綠色熒光甚弱。

6 胃癌與胃上皮細胞株中DNMT 的差異

免疫印記法研究DNMT 在胃癌與胃上皮細胞中表達差異，結果見圖6、7。DNMT3B 在GES－1 細胞中表達較MKN－45 和SGC－7901 細胞增強(P ＜0.05);DNMT2 和DNMT3L 在各細胞表達無顯著差異(P ＞0.05);而DNMT1 和DNMT3A 在各細胞幾無表達。

Figure 3. The positive expression of DNMT in 60 pairs of gastric cancer and corresponding non－cancerous tissues. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs non－cancerous tissue.圖3 DNMT 在60 對人胃癌及癌旁組織的陽性表達

Figure 4. Differential expression of DNMT between gastric cancer and corresponding non－cancerous tissues.－:expression of DNMT in non－cancerous tissue was lower than that in gastric cancer tissue. +:expression of DNMT in non－cancerous tissue was higher than that in gastric cancer tissue. 0:expression of DNMT in non－cancerous tissue was similar to that in cancer tissue. DNMT1 and DNMT3A expression in cancer tissues was lower than that in non－cancerous tissues (＊＊P ＜0.01，sign rank test). DNMT2 and DNMT3L expression in cancer tissues was lower than that in non－cancerous tissues (* P ＜0.05，sign rank test). The differential expression of DNMT3B between cancer and non－cancer was not significant .圖4 胃癌及配對癌旁組織的DNMT 差異

表1 不同胃癌臨床特征中DNMT 的表達差異Table 1. Differential expression of DNMT in different clinicopathologic features of gastric cancer［n(%)］

Figure 5. Fluorescence microscopy image of DNMT expression in cell lines(×100). A:DNMT2 was located in nucleus(SGC－7901);B:DNMT3B was located in cytoplasm(MKN－45).圖5 DNMT 表達定位

Figure 6. Protein expression of some DNMT in cell lines detected by Western blotting.圖6 部分DNMT 蛋白在胃癌細胞與胃黏膜上皮細胞表達

7 5－氮雜－2'－脫氧胞苷對胃癌與胃上皮細胞增殖的影響

噻唑藍比色法分析5－氮雜－2'－脫氧胞苷不同濃度及作用時間對SGC－7901、MKN－45 和GES－1 細胞增殖的影響，結果見圖8。5－氮雜－2'－脫氧胞苷對各細胞株增殖率無顯著影響(P ＞0.05)。

8 5－氮雜－2'－脫氧胞苷對胃癌細胞與胃黏膜上皮細胞周期分布與凋亡的影響

流式細胞術分析5－氮雜－2'－脫氧胞苷對胃癌細胞與胃黏膜上皮細胞周期分布和凋亡率的影響，結果見圖9、10。5－氮雜－2'－脫氧胞苷對各細胞株周期分布與凋亡無顯著影響(P ＞0.05)。

討 論

DNA 甲基化是表觀遺傳學在腫瘤領域的研究熱點［6］。異常DNA 甲基化可致腫瘤基因轉錄異常，并被看作腫瘤發(fā)展表觀遺傳機制之一［7］。因腫瘤具有整體基因組低甲基化及抑癌基因高甲基化的特點［8］，且DNMT 是催化DNA 甲基化修飾的生物酶，故普遍認為DNMT 在腫瘤中異常表達［9］。DNMT 可分DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B 和DNMT3L 5 種［10－11］。

一般理論是，各種DNMT 在腫瘤高表達，通過高甲基化抑癌基因并抑制其轉錄而促進腫瘤發(fā)展［12－13］。但腫瘤基因組也有整體甲基化率降低的特點［14］。例如正常細胞基因組CpG 島甲基化率高達80%，而癌細胞中則降低20%至60%［15］，此現(xiàn)象不能被DNMT 高表達所解釋。且不少研究證實癌基因低甲基化并激活亦是腫瘤重要表觀遺傳特點［4，14，16］，這讓我們疑惑“抑癌基因高甲基化失活”與“癌基因低甲基化激活”誰在腫瘤中起主導作用?加上新近資料［3］發(fā)現(xiàn)DNMT3A 在腫瘤中表達降低，并與腫瘤增殖、侵襲和轉移負相關(起抑癌基因作用)!又讓我們深思DNMT 低表達與癌基因低甲基化并激活的聯(lián)系，及此聯(lián)系與腫瘤的關系?？傊延胁簧儋Y料向腫瘤中DNMT 絕對高表達的理論提出挑戰(zhàn)。

Figure 7. Differential expression of some DNMT in different cell lines. DNMT3B expression was higher in GES－1 cells than in MKN－45 and SGC－7901 cells. ±s.n=3. ＊＊P ＜0.05 vs SGC－7901 and MKN－45.圖7 DNMT 在胃癌與胃上皮細胞的表達差異

Figure 8. The growth rates of different cell lines with 5－aza－2'－deoxycytidine treatment (MTT assay). A:SGC－7901 cells;B:MKN－45 cells;C:GES－1 cells. ±s.n=5.圖8 細胞株經(jīng)5－氮雜－2'－脫氧胞苷處理后的增殖率

Figure 9. The cell cycle distribution of cell lines with 5－aza－2'－ deoxycytidine treatment(flow cytometry analysis).C:control;T:treated with 5－aza－2'－deoxycytidine.±s.n=3.圖9 細胞株經(jīng)5－氮雜－2'－脫氧胞苷處理后的周期分布

Figure 10. The apoptotic rates of cell lines with 5－aza－2'－deoxycytidine treatment(flow cytometry analysis). ±s.n=3.圖10 細胞株經(jīng)5－氮雜－2'－脫氧胞苷處理后的凋亡率

本研究結果提示，“DNMT 高表達導致抑癌基因高甲基化并失活”可能并非胃癌發(fā)展的關鍵機制，至少胃癌中抑癌基因的高甲基化并非由DNMT 高表達所致。此外，抑制DNMT 可能對胃癌與胃上皮細胞增殖、周期分布、凋亡的影響也十分有限。至少在短期內(nèi)(5 d)，抑制DNMT 不對胃癌增殖、凋亡起決定性作用。故本文不支持腫瘤DNMT 絕對高表達并促癌發(fā)展的觀點。那么胃癌是否存在DNMT 低表達與癌基因低甲基化并激活的聯(lián)系?以及此聯(lián)系是否與胃癌發(fā)展相關?還有構建DNMT 過表達載體轉染胃癌細胞是否對其增殖、凋亡有影響?目前尚不能確定，亟待進一步實驗證實。

腫瘤表觀遺傳研究屬新興科研領域，未知性與不確定性強;近年此領域雖已獲不少進展，但可用于腫瘤臨床診治的仍稀少，故需更多學者前赴后繼的探索與付出。

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