三陰型乳腺癌FOXA1 和BRCA1 的表達(dá)及其對(duì)預(yù)后的意義*

蔣光愉， 李 紅， 何偉麗， 王寧霞△

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院1病理科，2乳腺外科，廣東 廣州510632)

2011 年，在瑞士圣加侖國(guó)際乳腺癌研討會(huì)上Gnant 等［1］總 結(jié) 了 三 陰 型 乳 腺 癌(triple negative breast cancer，TNBC)的臨床特點(diǎn)，概括為:(1)發(fā)病年齡低;(2)腫瘤直徑較大;(3)腫瘤惡性程度較高，腫瘤分化程度低，病理學(xué)分級(jí)高，常表現(xiàn)有基底樣乳腺癌的改變;(4)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較大;(5)5 年生存率低。TNBC 發(fā)病率在15% ～20%之間，治療手段單一，預(yù)后較非三陰型乳腺癌差，已成為目前國(guó)內(nèi)外乳腺癌研究的熱點(diǎn)。本研究應(yīng)用免疫組化法對(duì)三陰型、luminal 型和HER－2 過(guò)表達(dá)型乳腺癌組織中叉頭框蛋白A1(forkhead box protein A1，F(xiàn)OXA1)、BRCA1 蛋白、P53 和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)進(jìn)行比較，評(píng)估4 項(xiàng)指標(biāo)在預(yù)后方面的意義。

材 料 和 方 法

1 材料

收集本院2007 年10 月至2012 年1 月乳腺癌標(biāo)本113 例，根據(jù)免疫組化雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progestrone receptor，PR)和HER－2 的表達(dá)情況，分為3 組:A 組:ER、PR 和HER－2 均為陰性的TNBC 組，共42 例，平均年齡(45.12 ±10.73 )歲，腫瘤直徑平均為(3.98 ±2.78)cm;B 組:ER(+)和/或PR(+)、HER－2(－ / +)的luminal 組，共50 例，平均年齡(51.18 ±9.20)歲，腫瘤直徑平均(2.17 ± 1.23)cm;C 組:ER(－ )、PR(－)、HER－2(+ + / + + +)或熒光原位雜交(fluorescence in situ hybrilization，F(xiàn)ISH)檢測(cè)HER－2 陽(yáng)性的HER－2 過(guò)表達(dá)組，共21 例，平均年齡(50.29 ±10.43)歲，腫瘤直徑平均(2.87 ±1.38)cm。A 組為三陰組，B 和C 組為非三陰組。分析3 組間發(fā)病年齡、腫瘤大小、臨床分期、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移以及腫瘤病理組織學(xué)分級(jí)與FOXA1、BRCA1、P53 及VEGF 表達(dá)的相關(guān)性。

2 方法

113 例乳腺癌樣本切除后均用10%甲醛液固定后，經(jīng)脫水、石蠟包埋切成厚約4 μm 切片，用免疫組化EnVision 兩步法檢測(cè)3 組樣本FOXA1、BRCA1、P53 和VEGF 表達(dá)情況。FOXA1 多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz 生物制劑公司，工作濃度為1∶200;BRCA1鼠抗人抗體購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，工作濃度為1∶40。P53 單克隆抗體和VEGF 多克隆抗體購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，工作濃度均為1∶50。陽(yáng)性對(duì)照片為已知的陽(yáng)性表達(dá)片(由以上生物制劑公司提供)，陰性對(duì)照片為PBS 液代替Ⅰ抗進(jìn)行，每組每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)陰性對(duì)照片。

3 結(jié)果判斷

乳腺癌臨床分期根據(jù)2011 年乳腺癌臨床實(shí)踐指南(中國(guó)版)判定。

原發(fā)腫瘤大小(tumor，T):Tx:無(wú)法評(píng)估原發(fā)腫瘤;T0:沒(méi)有原發(fā)腫瘤證據(jù);Tis:原位癌;T1:≤2 cm;T2:2 ～5 cm;T3:≥5 cm，如果腫瘤略大于或小于某一臨界值，用四舍五入法進(jìn)行歸類(lèi)。

區(qū)域淋巴結(jié)(lymph node，LN or N):Nx:區(qū)域淋巴結(jié)無(wú)法評(píng)估(例如既往已切除);N0:無(wú)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;N1:1 ～3 個(gè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;N2:4 ～9 個(gè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;N3:10 個(gè)以上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(metastasis，M):M0:無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的臨床或影像學(xué)證據(jù);M1:體格檢查和影像學(xué)方法發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和(或)組織學(xué)證實(shí)超過(guò)0.2 mm 的轉(zhuǎn)移灶。

0 期:TisN0M0; Ⅰ期:T1N0M0、T0N1M0、T1N1M0(淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移);Ⅱ期:T0N1M0、T1N1M0、T2N0M0、T2N1M0、T3N0M0;Ⅲ 期: T0N2M0、T1N2M0、T2N2M0、T3N1M0、T3N2M0、T4N0M0、T4N1M0、T4N2M0、任何TN3M0;Ⅳ期:任何T 任何N，M1。

Nottingham Combined Histology Grade 改良的SBR 分級(jí)系統(tǒng)根據(jù):腺管形成程度、細(xì)胞核多形性、核分裂計(jì)數(shù);每項(xiàng)1 分(良好)～3 分(差)，3 類(lèi)分?jǐn)?shù)相加，1 級(jí):3 ～5 分;2 級(jí):6 ～7 分;3 級(jí):8 ～9 分。

FOXA1 在癌細(xì)胞的胞核表達(dá)，部分在胞漿表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)的百分比(P)分成11 個(gè)等級(jí):0 分:0;1 分:0 ～10%;2 分:10% ～20%;3 分:20% ～30%，依次類(lèi)推，最高為10 分。陽(yáng)性表達(dá)的強(qiáng)度(I)分成3 個(gè)等級(jí):1 級(jí):黃色;2 級(jí):棕黃色;3 級(jí):棕色。最后得分(S)=P×I，S 在0 ～3 分之間為表達(dá)陰性，S 在4 ～30分之間則為陽(yáng)性表達(dá)［2］。BRCA1 陽(yáng)性表達(dá)在正常細(xì)胞為細(xì)胞核，在癌細(xì)胞為細(xì)胞漿，棕黃色細(xì)胞數(shù)≥10%即為陽(yáng)性［3］。P53 陽(yáng)性表達(dá)表現(xiàn)為細(xì)胞核呈棕色，≥5%即為陽(yáng)性;VEGF 陽(yáng)性表達(dá)表現(xiàn)為細(xì)胞漿呈棕色，≥5%即為陽(yáng)性，見(jiàn)圖1。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。各組樣本率之間的差異用χ2檢驗(yàn)。各組臨床指標(biāo)間的比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料方差分析，方差不齊時(shí)，檢驗(yàn)各組間均數(shù)差異選用Tukey'sT2 法進(jìn)行比較，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Figure 1. Immunohistochemical staining of breast cancer tissues(× 100). A:FOXA1 negative expression;B:FOXA1 positive control;C:BRCA1 negative expression;D:BRCA1 positive expression ;E:VEGF negative expression;F:VEGF positive expression;G:P53 negative expression;H:P53 positive expression.圖1 乳腺癌組織4 種抗體免疫組化染色

結(jié) 果

1 各組臨床指標(biāo)間的比較

三陰組(A 組)患者發(fā)病年齡低于非三陰組(B和C 組)(P ＜0.05)，平均腫瘤直徑大于非三陰組(B和C 組)(P ＜0.05)，臨床分期Ⅱ期比率(52.4%)高于非三陰組(B 和C 組)，但在Ⅲ期比率中，A 組(38.1%)低于C 組(42.9%)，A 組復(fù)發(fā)率高于其它2 組(P ＜0.05)，見(jiàn)表1。

1.1 研究對(duì)象 2014年1月-2014年12月南京市胸科醫(yī)院的門(mén)診及住院呼吸系統(tǒng)疾病患者6 984例，男性4 681例，女性2 303例，年齡11～99歲，平均年齡（55.24±18.62）歲；按年齡分為五組，≤20歲組258例，20～40歲組1 322例，40～60歲組2 337例，60～80歲組2 626例，≥80歲組441例；按不同季節(jié)分組，春季（3-5月）1 931例，夏季（6-8月）1 742例，秋季（9-11月）1 650例，冬季（12-2月）1 661例；所有病例均存在呼吸道感染的臨床表現(xiàn)：持續(xù)性咳嗽、發(fā)熱、呼吸急促或呼吸困難；肺部聽(tīng)診可聞及細(xì)濕啰音等。所有患者均知情同意。

2 FOXA1 和BRCA1 在3 組中的表達(dá)情況

FOXA1 總的陽(yáng)性表達(dá)率為63.7%(72/113)，A組陽(yáng)性表達(dá)率為45.2%(19/42)，B 組陽(yáng)性表達(dá)率為88.0%(44/50)，C 組陽(yáng)性表達(dá)率為42.9%(9/21)，F(xiàn)OXA1 在3 組中的表達(dá)存在差異;BRCA1 總的陽(yáng)性表達(dá)率為47.8% (54/113)，A 組陽(yáng)性表達(dá)率為66.7%(28/42)，B 組陽(yáng)性表達(dá)率為44.0%(22/50)，C 組陽(yáng)性表達(dá)率為19.0%(4/21)，BRCA1 在3 組中的表達(dá)存在顯著差異(P ＜0.01)，見(jiàn)表2。

3 FOXA1 表達(dá)與臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系

FOXA1 陽(yáng)性表達(dá)樣本中腫瘤直徑均值為(2.81 ± 1.80)cm，小 于 陰 性 表 達(dá) 組［(3.42 ±2.67)cm］(P ＜0.05);FOXA1 陽(yáng)性表達(dá)率在Ⅰ(91.7%)、Ⅱ(64.0%)臨床分期中所占比例較大;在組織學(xué)分級(jí)1 級(jí)(88.9%)、2 級(jí)(61.2%)的組別中表達(dá)率較高(P ＜0.05);FOXA1 表達(dá)陽(yáng)性復(fù)發(fā)率(16.7%)低于FOXA1 表達(dá)陰性樣本(34.1%)(P＜0.05)，見(jiàn)表3。

表1 各組臨床情況Table 1. The clinical circumstances of each group

表2 FOXA1 和BRCA1 在各組的表達(dá)情況Table 2. FOXA1 and BRCA1 expression in each group

4 BRCA1 表達(dá)與臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系

BRCA1 陽(yáng)性表達(dá)樣本中腫瘤直徑均值為(3.55±2.63)cm，大于陰性表達(dá)組［(2.54 ±1.35)cm］(P＜0.05);BRCA1 陽(yáng)性表達(dá)率在Ⅲ(61.4%)臨床分期中所占比例較大(P ＜0.05);在組織學(xué)分級(jí)3 級(jí)(58.7%)的組別中表達(dá)率較高(P ＜0.05);BRCA1陽(yáng)性表達(dá)復(fù)發(fā)率為(69.2%)，高于BRCA1 陰性表達(dá)組(30.8%)(P ＜0.05)，見(jiàn)表3。

表3 FOXA1 和BRCA1 表達(dá)與各臨床病理指標(biāo)的關(guān)系Table 3. The relationship between FOXA1 and BRCA1 expression and the clinicopathological parameters

5 FOXA1 表達(dá)與P53 和VEGF 表達(dá)的關(guān)系

FOXA1 在P53 陰性表達(dá)樣本中的陽(yáng)性表達(dá)率為74.1%(43/58)，高于P53 陽(yáng)性表達(dá)組［52.7%(29/55)］(P ＜0.05);FOXA1 在VEGF 陰性表達(dá)樣本中的陽(yáng)性表達(dá)率為73.2%(41/56)，高于VEGF 陽(yáng)性表達(dá)組［54.4%(31/57)］(P ＜0.05)，見(jiàn)表4。

6 BRCA1 表達(dá)與P53 和VEGF 表達(dá)的關(guān)系

BRCA1 在P53 陽(yáng)性表達(dá)樣本中的陽(yáng)性表達(dá)率為61.8% (34/55)，高于P53 陰性表達(dá)組［34.5%(20/58)］(P ＜0.05);BRCA1 在VEGF 陽(yáng)性表達(dá)的樣本中的陽(yáng)性表達(dá)率為59.6%(34/57)，高于VEGF陰性表達(dá)組［35.7%(20/56)］(P ＜0.05)，見(jiàn)表4。

表4 FOXA1 和BRCA1 表達(dá)與P53 和VEGF 表達(dá)的關(guān)系Table 4. The relationship between FOXA1，BRCA1 expression and P53，VEGF expression

討 論

乳腺癌是一類(lèi)復(fù)雜而多變的全身性疾病，乳腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展往往伴隨乳腺組織多方面生物學(xué)行為改變。目前，公認(rèn)的乳腺癌分子亞型是［1］:luminal A 型(ER 和/或PR 陽(yáng)性，HER－2 陰性，Ki 67表達(dá)＜14%)，luminal B 型(ER 陽(yáng)性或PR 陽(yáng)性，HER－2 陽(yáng)性，Ki 67 表達(dá)＞14%)，HER－2 過(guò)表達(dá)型(Her－2 + + +或HER－2 + +或FISH +)，basal－like 型(ER、PR 和HER－2 均為陰性，CK5/6 及EGFR 呈陽(yáng)性表達(dá))。然而，乳腺癌并不能被幾類(lèi)或者幾個(gè)亞型很好地概括。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展及其在乳腺癌研究中的應(yīng)用，已鑒定出越來(lái)越多能反映預(yù)后和提供治療靶點(diǎn)的標(biāo)記物。三陰型乳腺癌是基因表達(dá)譜分析(analysis of gene express profiles)應(yīng)用于臨床后，被逐漸認(rèn)識(shí)到的一個(gè)乳腺癌亞型，它有特殊的病理特征和較差的預(yù)后而成為研究熱點(diǎn)。因此，乳腺癌的分型仍需要更多的病理學(xué)依據(jù)。除此之外，不同亞型的乳腺癌在治療效果及預(yù)后有明顯差別，并不能完全用其劃分的幾個(gè)生物學(xué)指標(biāo)來(lái)解釋。

1 三陰型乳腺癌的臨床情況

2 FOXA1 表達(dá)與臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系

叉頭框蛋白(FOX)是DNA 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及保護(hù)家族成員之一，它調(diào)控著生物演化的多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。FOX 因子的丟失和擴(kuò)增都可能改變細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境以及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)展。叉頭框基因是在果蠅的生物學(xué)研究中被發(fā)現(xiàn)并命名的，第一例被檢測(cè)到的哺乳動(dòng)物叉頭框蛋白是FOX A 組的成員［3］。FOX 家族共有17 個(gè)成員，從FOXA 到FOXR，是嚴(yán)格按照FOX 基因轉(zhuǎn)錄的，各成員在調(diào)控生物學(xué)行為方面呈現(xiàn)多樣性，包括細(xì)胞的新陳代謝、生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移與更新。這些步驟與細(xì)胞的生長(zhǎng)與自我穩(wěn)定密切相關(guān)，所以FOX 蛋白的丟失與突變將導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的生成與發(fā)展。目前，已經(jīng)被證實(shí)與腫瘤細(xì)胞相關(guān)的FOX 家族蛋白包括:FOXO、FOXM、FOXP、FOXC 及FOXA［4］。

Badve 等［2］發(fā)現(xiàn)FOXA1 總的陽(yáng)性表達(dá) 率為63.4%，其中在luminal A 組的陽(yáng)性表達(dá)率為84%，luminal B 組陽(yáng)性表達(dá)率為40.7%，F(xiàn)OXA1 表達(dá)情況與乳腺癌生存率呈正相關(guān)，在預(yù)后較好的luminal 型乳腺癌中，F(xiàn)OXA1 陽(yáng)性表達(dá)具有更好的無(wú)病生存率(disease－free survival，DFS)。本研究FOXA1 的總陽(yáng)性表達(dá)率為63.7%，A 組陽(yáng)性表達(dá)率為45.2%(19/42)，B 組陽(yáng)性表達(dá)率為88.0%(44/50)，C 組陽(yáng)性表達(dá)率為42.9%(9/21)，F(xiàn)OXA1 在3 組中的表達(dá)存在差異;luminal 組(B 組)中FOXA1 陽(yáng)性表達(dá)率較高(88%)，與Badve 的研究接近，說(shuō)明了FOXA1 在非三陰組表達(dá)最高。同時(shí)本組資料還顯示FOXA1陽(yáng)性表達(dá)的乳腺癌臨床分期早，具有較好的組織學(xué)形態(tài)和較低的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，與腫瘤惡性指標(biāo)P53 和VEGF 負(fù)相關(guān)，因此，可將FOXA1 作為乳腺癌良好預(yù)后的指標(biāo)。

3 BRCA1 表達(dá)與臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系

BRCA1 基因位于人染色體17q21 區(qū)域上，全長(zhǎng)100 kb，含24 個(gè)外顯子。正常情況下，野生BRCA1蛋白對(duì)正常細(xì)胞的生長(zhǎng)有重要作用，主要是進(jìn)行DNA 雙螺旋機(jī)構(gòu)的修復(fù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂周期的正常進(jìn)行。突變BRCA1 相關(guān)乳腺癌所占比率較高，家族性乳腺癌中BRCA1 的突變率達(dá)20%～30%，在家族性卵巢癌的突變率較低，約10%～20%。有資料顯示，50%的家族性乳腺癌及90%的家族性卵巢癌均存在生殖細(xì)胞上的BRCA1 基因突變［5］。BRCA1 突變基因攜帶者的比率約3%，BRCA1 突變基因攜帶者患乳腺癌的機(jī)率是55%～85%。并有研究表明，具有生殖細(xì)胞上BRCA1 突變的家族表現(xiàn)出較高的乳腺癌及卵巢癌的易感性，這類(lèi)病人患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)性是85%，患卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)率為60%，而且患者的發(fā)病年齡小于35 歲比率較大［6］。因此，突變BRCA1 蛋白是了解乳腺癌發(fā)展趨勢(shì)及評(píng)估預(yù)后的指導(dǎo)性指標(biāo)，本研究中檢測(cè)的BRCA1 即為突變型BRCA1 基因相關(guān)蛋白。

絕大多數(shù)的乳腺癌BRCA1 基因突變攜帶者產(chǎn)生癌癥有類(lèi)似基底細(xì)胞樣乳腺癌的改變，包括激素受體陰性、高組織學(xué)分級(jí)、血管轉(zhuǎn)移、預(yù)后較差的臨床病理特點(diǎn)［7］以及Ki67 高表達(dá)和P53 突變［8－9］。免疫組化或基因芯片技術(shù)檢測(cè)三陰型乳腺癌中有50%以上表達(dá)BRCA1［10－11］。本研究BRCA1 在乳腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為47.8%(54/113)，A 組陽(yáng)性表達(dá)率為66. 7% (28/42)，B 組陽(yáng)性表達(dá)率為44. 0%(22/50)，C 組陽(yáng)性表達(dá)率為19.0%(4/21)，明顯提示BRCA1 在三陰型組中陽(yáng)性表達(dá)率最高。同時(shí)本組資料還顯示BRCA1 陽(yáng)性的乳腺癌具有臨床分期晚、病理組織學(xué)分級(jí)高、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)。

4 FOXA1 和BRCA1 表達(dá)與P53 和VEGF 表達(dá)的關(guān)系

研究證明，許多腫瘤的發(fā)生與p53 基因的異常表達(dá)和突變有關(guān)［12］，而腫瘤的演進(jìn)與VEGF 有關(guān)。本研究顯示FOXA1 陽(yáng)性的乳腺癌與腫瘤惡性程度指標(biāo)P53 和VEGF 呈負(fù)相關(guān);BRCA1 陽(yáng)性的乳腺癌與P53 和VEGF 呈正相關(guān)。

綜上所述，F(xiàn)OXA1 有可能作為乳腺癌預(yù)后良好的指標(biāo)。而B(niǎo)RCA1 在三陰型乳腺癌中的表達(dá)率明顯高于非三陰組，還與多項(xiàng)乳腺癌不良指標(biāo)相關(guān)，表明檢測(cè)異位BRCA1 蛋白可以作為乳腺癌預(yù)后不良的指標(biāo)。

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