納米β-磷酸三鈣/膠原復(fù)合兔骨髓間充質(zhì)干細胞修復(fù)兔頜骨缺損的實驗研究*

劉星綱 梅 芳 呂培軍 王新知

頜骨缺損的修復(fù)一直是口腔臨床上的難題之一。修復(fù)方法很多，自體骨和異體骨均存在自身難以克服的缺點。利用支架材料與種子細胞復(fù)合構(gòu)建的人工骨被認(rèn)為是當(dāng)今骨缺損治療研究中的一個熱點。 但是以往支架材料的構(gòu)建較多的使用強度大而降解性能差的材料[1]。近年來有學(xué)者嘗試使用降解性能更佳的β 磷酸三鈣修復(fù)骨缺損取得了良好的成骨效果[2]。我們與浙江大學(xué)合作研發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的納米β-磷酸三鈣/膠原(Nβ-TCP/Co)在前期研究中證明降解性能雙向可調(diào)，具有良好的微觀結(jié)構(gòu)與宏觀可塑性，生物相容性較好[3]。本實驗考慮采用NβTCP/Co作為載體，與兔自體骨髓間充質(zhì)干細胞(bonemesenchymal stem cells,BMSCs)復(fù)合成人工骨，初步探討其修復(fù)骨缺損的效果，為骨組織工程支架材料的進一步研究和臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

1.材料與方法

1.1實驗動物與材料 3－4月齡新西蘭大白兔兩只，北大醫(yī)學(xué)部動物部提供并負責(zé)日常飼養(yǎng)。醫(yī)藥級甘氨酸由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供。基于前期試驗結(jié)果，配成10g/L甘氨酸液，過濾除菌后備用[4]。NβTCP/Co是與浙江大學(xué)合作研發(fā)，主要成分是納米級β 相磷酸三鈣與I型膠原，重量比為2∶1，將材料制成直徑6mm，厚度1mm 的圓片，包裝后鈷60輻照消毒備用。DMEM/F12培養(yǎng)液由美國Hyclon公司提供。成骨誘導(dǎo)液成分為含10%FBS的DMEM 培養(yǎng)液，10mmol/Lβ 甘油磷酸鈉，0.05mmol/L維生素C和100mm ol/L地塞米松。

1.2兔BMSCs的獲取、分離、傳代擴增與成骨誘導(dǎo) 參照文獻，定位坐骨穿刺點[5]。兔常規(guī)備皮，消毒，全身麻醉后，在無菌條件下使用16號骨穿針在坐骨處穿刺，約得1m l左右紅色液體即拔出骨穿針，肝素抗凝，操作過程注意避免細菌污染。采用全骨髓培養(yǎng)法進行原代培養(yǎng)。兔骨髓接種后20－48h根據(jù)細胞貼壁情況首次換液。以后每3－4d換液，細胞生長匯合達到70－80%時胰酶加乙二胺四乙酸(Ethy lene Diam ine Tetraacetic Acid,EDTA)消化，1∶2傳代。

取上述3－4代細胞爬片，成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)7天后取出，丙酮4℃固定30m in后取出，入堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)孵育液，未誘導(dǎo)細胞做為空白對照。

取上述3－4代細胞爬片，成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)21天后取出，丙酮4℃固定30m in后，結(jié)節(jié)2%茜素紅染色。未誘導(dǎo)細胞做為空白對照。

1.3兔BMSCs與NβTCP/Co-復(fù)合物修復(fù)兔頜骨缺損 將獲得的兔BMSCs傳至第三代，EDTA＋胰酶消化后，用含有10g/L甘氨酸的DMEM/F12培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至2×107個/m l。根據(jù)前期研究成果，該濃度的甘氨酸既可有效拮抗人工骨制備過程中殘留的戊二醛的細胞毒性，又不明顯抑制細胞的生長。使種子細胞與支架材料復(fù)合良好。用5m l無菌注射器吸取配置好的細胞懸液，小心滴加至人工骨表面，兩片人工骨共約滴加懸液0.5m l左右。每只動物制備3片人工骨種子細胞復(fù)合體。放入24孔培養(yǎng)板用同種培養(yǎng)液培養(yǎng)3d后，取出一片吸干液體后滴加少量噻唑藍[(3-(4,5-dimethy lthiazol-2-y l)-2,5-dipheny ltetrazolium brom ide,MTT]，10m in后，觀察材料如果變?yōu)樗{色，提示有活細胞存在。則將剩余兩片人工骨種子細胞復(fù)合體做自體動物回植。動物分組采用自身對照方法，在兩只兔雙側(cè)下頜骨各制備10mm×8mm大小箱狀人工骨缺損，修整植入體外形以使其能夠嚴(yán)密充填骨缺損腔。實驗側(cè)植入人工骨種子細胞復(fù)合體，對照側(cè)植入單純NβTCP/Co。10w 后處死實驗動物，觀察成骨效果。

2.結(jié)果

2.1抽取的兔骨髓接種在培養(yǎng)皿內(nèi)即刻，見少許單核細胞，圓形，未貼壁(圖1a)。24h左右，可見少量細胞開始貼壁，并伸展變形(圖1b)。之后細胞漸增多，呈梭狀(圖1c、d)。原代細胞培養(yǎng)14d左右可以進行傳代。隨著傳代增加，細胞生長速度漸漸加快，3-4代時，細胞同一性較好，生長活躍；但當(dāng)傳至10代以后，生長速度下降，出現(xiàn)老化現(xiàn)象。

圖1 兔紅骨髓倒置相差顯微鏡下圖像

2.2 ALP染色及茜素紅染色 成骨誘導(dǎo)后的細胞ALP染色鏡下見棕黑色沉淀物，位于細胞內(nèi)。未誘導(dǎo)的細胞未見明顯黑色沉淀，ALP染色著色不明顯(見圖2)。2%茜素紅染色鏡下可見大量棕紅色鈣化結(jié)節(jié)形成，結(jié)節(jié)附著于培養(yǎng)板底壁，不能移動(見圖3)?？梢姵晒钦T導(dǎo)后(a)大量棕黑色物質(zhì)位于細胞內(nèi)，未誘導(dǎo)細胞(b)未見明顯棕黑色沉淀物。

圖2 兔BMSCs3-4代細胞ALP染色鏡下圖像

圖3 兔BMSCs3-4代細胞2%茜素紅染色鏡下圖像。鏡下可見大量棕紅色鈣化結(jié)節(jié)形成，結(jié)節(jié)附著于培養(yǎng)板底壁，不能移動。

圖4 10w時兔頜骨標(biāo)本?？梢娚戏綄嶒灲M皮質(zhì)骨較為光滑、連續(xù)，與周圍骨質(zhì)相似；下方對照側(cè)較多索條狀新生骨，與周圍骨質(zhì)區(qū)別明顯。

2.3頜骨標(biāo)本肉眼觀察 10w 時，骨缺損表面均已完全骨性修復(fù)，但實驗側(cè)骨外形比對照側(cè)豐滿，表面骨皮質(zhì)比較光滑、連續(xù)。對照側(cè)骨缺損大部愈合，但表面骨皮質(zhì)仍有不連續(xù)處，原骨缺損區(qū)表面骨質(zhì)不光滑(圖4)。

2.4頜骨標(biāo)本組織切片觀察 兩側(cè)均可見原缺損區(qū)有骨質(zhì)出現(xiàn)，內(nèi)部均可見少量支架材料殘余。(圖5、圖6)。

圖5 10w時兔頜骨組織切片

圖6 10w時兔頜骨組織切片

3.討論

兔BMSCs與NβTCP/Co構(gòu)建的人工骨修復(fù)兔頜骨缺損，10w時骨外形比對照側(cè)豐滿，與周圍正常骨質(zhì)外形相似；而對照側(cè)尚有許多索條狀新生骨，外形與周圍骨質(zhì)差別明顯，處于骨改建過程中，實驗結(jié)果證實了骨髓間充質(zhì)細胞對成骨的促進作用。分析其原因可能為：具有一定濃度的BMSCs植入骨缺損區(qū)后可以向成骨細胞方向分化，從而保證早期就有充足的成骨細胞參與成骨，加速了成骨的過程，在相同時間內(nèi)成骨量要多于單純?nèi)斯す侵踩虢M。提示在臨床中β－磷酸三鈣/膠原與人自體骨髓間充質(zhì)細胞復(fù)合后可以加速成骨過程。

鄂玲玲，劉洪臣等[6]曾在兔下頜牙槽骨制備10×4×3mm骨缺損，術(shù)后12w未見明顯新生骨形成，認(rèn)為其為一種極限骨缺損模型。Schm itz，JP[7]和Thomaidis，V[8]報道兔頜骨極限缺損的尺寸大于等5mm。因此，本實驗所用骨缺損模型可認(rèn)為是一種極限骨缺損。在前期研究中，單純β-磷酸三鈣/膠原復(fù)合體在12w時可以完全修復(fù)同類型兔頜骨缺損。基于盡量減少使用實驗動物數(shù)量的原則，我們選擇只在10w時觀察成骨效果，以便于較為敏感的觀察種子細胞的作用。

本實驗采用了口外入路的下頜骨中部箱型骨缺損模型，成骨影響因素相對較少，便于分析；不與口腔相通，便于無菌操作；需要時該模型也可以包含牙周組織。該處骨結(jié)構(gòu)與人下頜骨體部類似，為雙層皮質(zhì)骨，內(nèi)為松質(zhì)骨，且含有牙周結(jié)構(gòu)。去除頰面皮質(zhì)骨后很容易制備成箱型植骨床，易于填充缺損區(qū)，且不需要輔助固位技術(shù)，影響成骨的因素除植骨材料外相對較少,易于檢驗人工骨的效果。兔下頜骨缺損的具體位置有不同報道，2002年胡秀蓮，林野等[9]采用位于下頜角，相當(dāng)于升支處的洞穿型骨缺損，實驗結(jié)果表明該處5mm×5mm洞穿骨缺損無法自愈，使用可吸收膜后成骨也欠理想。推測其原因可能為該處骨質(zhì)菲薄，為厚度不足0.5mm的皮質(zhì)骨，且兩邊為強大的咀嚼肌，難以形成足夠的植骨間隙。我們前期的實驗也證明采用該種缺損模型成骨量較少，難以定量分析，且成骨效果不穩(wěn)定[10]。

對于骨組織工程的最適種子細胞濃度目前不同學(xué)者間尚未達成共識[11-13]。大量高密度種子細胞的接種對于構(gòu)建組織的結(jié)構(gòu)維持與功能發(fā)揮是至關(guān)重要的[14]，但是種子細胞接種密度也不是越高越好。密度過高會造成細胞的過度堆積，營養(yǎng)供給不良導(dǎo)致過量細胞死亡，造成種子細胞的浪費。這一點在較大體積骨缺損的修復(fù)中尤其重要。同時也要考慮生物材料吸水性的不同而調(diào)整細胞密度。比如同體積的聚乳酸與殼聚糖生物材料，因聚乳酸吸水性較好，如果接種時細胞懸液的濃度相同，必然會造成聚乳酸因吸收較多的液體而在相同體積的材料內(nèi)容納了較多的細胞，此時可以將細胞懸液的濃度適當(dāng)較低一些。有研究證明，單位重量脫鈣骨對骨髓間充質(zhì)干細胞的最大黏附數(shù)量為3.5×107/g，接種細胞濃度在5×105/m l時黏附率最高[15]。這可以作為一個參考的基準(zhǔn)。本實驗選擇的種子細胞濃度為2×107個/m l，是綜合考慮能夠獲得的種子細胞數(shù)量，所用支架材料的性能，以及頜骨良好的血供。實驗結(jié)果證實該濃度的種子細胞顯示出良好的促進骨愈合的作用。

3－4代骨髓間充質(zhì)干細胞體外成骨誘導(dǎo)后，鈣化結(jié)節(jié)及ALP染色與誘導(dǎo)前比較明顯增強，提示獲取的兔骨髓間充質(zhì)干細胞可以向成骨細胞方向分化，可以用于體內(nèi)成骨實驗。該結(jié)果與其他學(xué)者研究結(jié)果相同[16,17]。

文獻報道的兔骨髓穿刺的部位可以有股骨、脛骨、髂骨及坐骨。采用股骨等長骨部位的實驗較多，髂骨也有報道，坐骨少見。在前期的實驗中發(fā)現(xiàn)，髂骨是可以提取出骨髓間充質(zhì)細胞的，但是因為髂骨較薄，操作過程中落空感不明顯，骨穿針較易穿透整個髂骨造成失敗。而坐骨不僅同為不規(guī)則骨，且較髂骨為厚，并且有可以體表定位的骨性解剖標(biāo)志，選擇坐骨做為骨髓穿刺的位置，針刺時落空感明顯，可抽取所需的骨髓量，最終結(jié)果證實取材滿意，達到實驗要求。因此坐骨是較好的兔骨髓穿刺部位。

Nβ-TCP/Co結(jié)合兔BMSCs對于更大骨缺損修復(fù)能力尚有待檢驗。

綜上所述，兔BMSCs與Nβ-TCP/Co結(jié)合后回植入兔頜骨人工骨缺損區(qū)后，可以良好成骨，成骨較單純納米β-磷酸三鈣/膠原復(fù)合體好。

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