肉桂抑制α-葡萄糖苷酶活性成分研究

許芹永，朱靖博，2*，王振中，肖 偉

1大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院;2大連工業(yè)大學(xué)植物資源化學(xué)與應(yīng)用研究所，大連116034;3江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，連云港222001

肉桂為樟科植物肉桂(Cinnamomum cassia Presl)的干燥樹皮，其性味辛、甘、大熱，具有補火助陽，引火歸源，散寒止痛，活血通經(jīng)之功效［1］。肉桂的主要成分為桂皮醛、肉桂酸、醋酸苯丙酯、醋酸桂皮酯、肉桂醇、香豆素等。此外，尚含膽堿、β-谷甾醇、原兒茶酸、鞣質(zhì)、水芹烯、丁香油酚等［2，3］。肉桂中含揮發(fā)油1%～2%左右，胥新元等［4］研究表明，肉桂揮發(fā)油具有降血糖的作用，故可對肉桂揮發(fā)油部分進行進一步的分離純化，以期獲得活性更高的單體化合物。

α-葡萄糖苷酶抑制劑可抑制小腸內(nèi)α-葡萄糖苷酶的活性，延緩或抑制葡萄糖在腸道的吸收，從而有效降低餐后高血糖。由于其獨特的優(yōu)勢，α-葡萄糖苷酶抑制劑已被第三次亞太地區(qū)糖尿病治療藥物指南推薦為降餐后血糖的一線藥物［5］。醫(yī)學(xué)界已將α-葡萄糖苷酶抑制劑列為第3類口服降糖藥［6］，如由德國拜耳公司研制的阿卡波糖在臨床上已被廣泛用于糖尿病及其并發(fā)癥的防治。但是由于阿卡波糖能夠引起某些嚴重的副作用，以α-葡萄糖苷酶為靶分子，從中藥中尋找α-葡萄糖苷酶抑制劑已成為一個世界性的熱點［7-11］。目前，α-葡萄糖苷酶抑制劑體外篩選普遍采用分光光度法作為檢測手段，但試劑消耗大，且重現(xiàn)性差，尤其對復(fù)雜樣品或有顏色干擾的樣品，假陽性高［12］。因此，本研究首次利用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)結(jié)合體外抑制α-葡萄糖苷酶活性篩選模型，從肉桂的石油醚活性部位追蹤分離，得到2個具有抑制α-葡萄糖苷酶的活性單體。

1 儀器與材料

500 MHz AVANCE型核磁共振波譜儀，瑞士Bruker公司;Spectrum One-B型傅立葉變換紅外光譜儀，美國鉑金埃爾默公司;UltiMate 3000高效液相色譜分析儀，美國DIONEX公司;微型植物粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司;R502B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生科技有限公司;HWS-26型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司;SK-1型快速混勻器，常州國華儀器有限公司。

α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20，面包酵母，純度≥10 U/mg)，sigma公司;對-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷，PNPG，純度 99%，sigma公司;對-硝基酚，PNP，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司;牛血清白蛋白，BSA，純度≥95%，sigma公司;阿卡波糖，Acarbose，50 mg/片，拜耳醫(yī)藥保健有限公司;柱色譜和薄層色譜用硅膠，購自青島海洋化工廠。肉桂于2010年10月購自河北安國中藥材市場，經(jīng)鑒定為Cinnamomum cassia Presl的干燥樹皮。

2 實驗方法

2.1 α-葡萄糖苷酶抑制劑活性組分的跟蹤分離

干燥肉桂2 kg，粉碎后，用石油醚加熱回流提取3次，每次3 h，過濾，回收濾液，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，得到石油醚提取物(Cp，35.7 g)。利用體外篩選模型，對Cp進行酶活測試，Cp對α-葡萄糖苷酶活性具有抑制作用，并且高于陽性對照藥物阿卡波糖，所以采用活性追蹤方式對Cp進行追蹤分離。

將Cp經(jīng)過200～300目硅膠柱色譜，正己烷-乙酸乙酯梯度洗脫(10∶1～1∶1)，得到5個部分，其中第2部分(Cp-2，6.8 g)和第3部分(Cp-3，2.4 g)具有抑制α-葡萄糖苷酶活性。Cp-2部分經(jīng)過硅膠柱色譜，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫(10∶1～7∶3)，得到化合物桂皮醛(2.8 g，1)。Cp-3部分經(jīng)硅膠柱色譜，正己烷-乙酸乙酯梯度洗脫(10∶0～1∶1)，以TLC檢測合并，再經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚-乙酸乙酯洗脫(9∶1)，石油醚-乙酸乙酯重結(jié)晶，得到化合物肉桂酸(230 mg，2)。

2.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性成分的篩選方法

2.2.1 檢測方法

本實驗采用高效液相色譜法，反應(yīng)體系參照朱文佳［13］所建立的體外α-葡萄糖苷酶抑制劑篩選模型，并在其基礎(chǔ)上加以優(yōu)化改進，按照下式計算抑制率，并用Origin軟件求出相應(yīng)IC50值。

式中，A為不加待測樣品的PNP濃度(扣除相應(yīng)空白，mmol/L);B為加入待測樣品后PNP的濃度(扣除相應(yīng)空白，mmol/L)。

色譜條件:Sino Chrom ODS-BP色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm，大連依利特分析儀器有限公司);流動相:A為乙腈，B為含0.1%甲酸的水溶液，梯度洗脫條件為:0～8 min，20% ～30%A;8～13 min，30%～80%A;13～18 min，80% ～20%A;18～28 min，20%A);流速:1.0 mL/min;進樣量:20 μL;柱溫:常溫;檢測波長:315 nm。

2.2.2 標準曲線制作

根據(jù)采用的反應(yīng)體系，精確稱取0.0209 g PNP標準品，用磷酸鹽緩沖溶液，超聲溶解，定容于25 mL容量瓶中，配制成6 mmol/L的PNP母液，將其稀釋成0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.01、0.005、0.0025 mmol/L。分別取7個不同濃度的PNP溶液各80 μL，加入0.2 mol/L Na2CO3溶液80 μL，用超純水稀釋至500 μL，混勻，過0.45 μm濾膜，HPLC檢測，檢測波長為315 nm。以PNP峰面積為縱坐標，PNP濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

2.2.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

實驗在1.5 mL離心管中進行，根據(jù)所采用的反應(yīng)體系(總體積為160 μL):25 μL pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液、5 μL 10 mg/mL待測樣品，30 μL 0.1 U/ mL α-葡萄糖苷酶，震蕩混勻，37℃孵育20 min，加入20 μL 4.0 mmol/L PNPG開啟反應(yīng)，震蕩混勻，37℃反應(yīng)30 min后，加入80 μL 0.2 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，加超純水稀釋至500 μL，震蕩混勻，經(jīng)0.45 μm膜過濾后，用HPLC檢測，通過產(chǎn)物PNP的濃度變化，計算α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

酶活力單位定義:37℃，pH 6.8條件下，每分鐘水解底物所產(chǎn)生1 μmol PNP的酶量，規(guī)定為1個酶活力單位(U)［13］。

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 黃色油狀物，UV λmax(MeOH)nm: 225，289。IR νmax(KBr)cm-1:2926，2740～2854，1679，1626，973，748，689。1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:6.72(1H，dd，J=8.0，16.0 Hz，H-2)，7.42～7.58(6H，m，H-3，5，6，7，8，9)，9.70(1H，d，J= 7.65 Hz，H-1)。13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:128.5 (C-5，C-9)，128.6(C-7)，129.1(C-6，C-8)，131.2 (C-4)，134.0(C-3)，152.7(C-2)，193.6(C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻［15］報道一致，故確定1為反式桂皮醛。

化合物2 白色粉末，mp.133～134℃。UV λmax(MeOH)nm:223，278。IR νmax(KBr)cm-1:2614～3025，1683，1631，766，705。1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:6.46(1H，d，J=16.0 Hz，H-3)，7.40(3H，m，H-6，7，8)，7.55(2H，m，H-5，9)，7.80(1H，d，J= 16.0 Hz，H-2)。13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:117.3 (C-7)，128.4(C-5，C-9)，129.0(C-6，C-8)，130.8 (C-4)，134.1(C-3)，147.1(C-2)，172.2(C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻［15］報道一致，故確定2為反式肉桂酸。

3.2 抑制α-葡萄糖苷酶活性成分的篩選

從肉桂石油醚提取物Cp中分離得到5個部分，篩選發(fā)現(xiàn)第2部分和第3部分為活性部分，從中繼續(xù)分離得到2個活性化合物。從表1可以看出，2個化合物初篩抑制率均高于陽性對照藥物阿卡波糖，而IC50均遠小于阿卡波糖，具有很高的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

康文藝等［16］利用UV-2000型紫外可見分光光度計在405 nm測得阿卡波糖體外抑制α-葡萄糖糖苷酶活性的IC50值為1081.27 μg/mL。該研究選擇的保溫時間(15 min)、反應(yīng)體系總體積(160 μL)、檢測儀器和波長(405 nm)等與本研究不同，但阿卡波糖的IC50值很接近，表明本研究利用的篩選模型及檢測方法穩(wěn)定、準確可靠。

表1 不同提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性Table 1 α-Glucosidase inhibitory activity of extracts and compounds of C.cassia

3.3 受試化合物對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

受試化合物不同質(zhì)量濃度對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響如圖1所示，2個化合物對α-葡萄糖苷酶抑制活性均與濃度呈正量效關(guān)系，即劑量依賴性，抑制活性隨著受試化合物質(zhì)量濃度的提高而增強，并且1的活性稍高于2。

圖1 受試化合物質(zhì)量濃度對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響Fig.1 The mass concentrations of compounds effect on inhibitory activity of α-glucosidase

3.4 受試化合物抑制類型的確定

2個化合物分別取合適的2個不同濃度，PNPG取5個不同濃度，分別測定反應(yīng)速度。按 Lineweave-Burk作圖法，以1/［S］為橫坐標，1/V為縱坐標(［S］為底物濃度，V為反應(yīng)速度)，繪制2個化合物的抑制動力學(xué)曲線(圖2～3)，得到α-葡萄糖苷酶的Km的值為1.06 mmol/L。

從圖2和3可以看出，化合物1和2對α-葡萄糖苷酶抑制作用屬于非競爭性抑制，反應(yīng)速度Vmax隨著受試化合物濃度的增大而變小，米氏常數(shù)Km保持不變［17］。根據(jù)非競爭性抑制動力學(xué)方程［16］: 1/V'max=1/Vmax(1+［I］/Ki)，可以求出2個化合物的Ki值分別為178.07 μg/mL和229.43 μg/mL。

4 結(jié)論

本研究首次采用以HPLC作為檢測手段的α-葡萄糖苷酶抑制活性體外篩選模型，對肉桂石油醚提取物進行活性追蹤分離，得到2個活性單體化合物，活性遠高于陽性對照藥物阿卡波糖。化合物1和2對α-葡萄糖苷酶抑制作用均屬于非競爭性抑制類型，說明它們既可以和酶結(jié)合，也可以和酶-底物復(fù)合物結(jié)合，從而降低酶活性，實現(xiàn)降血糖的作用。

1 National Pharmacopoeia Committee(國家藥典委員會).Chinese pharmacopoeia中國藥典(一部).Beijing:Chemical Industry Press，2005.91-92.

2 Xiao PG(肖培根).New journal of Chinese Materia Medica (新編中藥志，第三卷).Beijing:Chemical Industry Press，2002.576-579.

3 Song LR(宋立人).Textual research on Cinnamomum Eassia Blume.J Nanjing Univ TCM(南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報)，2001，17(2):73-75.

4 Xu XY(胥新元)，Peng YM(彭艷梅)，Peng YG(彭源貴)，et al.Experimental studies on hypoglycemic effects of Cinnamon essential oil.Chin J Info TCM(中國中醫(yī)藥信息雜志)，2001，8(2):26.

5 Gu JF(顧覺奮)，Chen ZJ(陳紫娟).The studies and applications of α-glucosidase inhibitors.Prog Pharm Sci(藥學(xué)進展)，2009，33(2):62-67.

6 Du WQ(杜偉奇)，Shi XF(施秀芳)，Qiu MY(邱明艷)，et al.Research progress on treatment of diabetes drugs.Chin J Hosp Pharm(中國醫(yī)院藥學(xué)雜志)，2005，25:67-69.

7 Jong-Anurakkun N，Bhandari MR，Hong G，et al.α-Glucosidase inhibitor from Chinese aloes.Fitoterapia，2008，79:456-457.

8 Lam SH，Chen JM，Kang CJ，et al.α-Glucosidase inhibitors from the seeds of Syagrus romanzoffiana.Phytochemistry，2008，69:1173-1178.

9 Lee SS，Lin HC，Chen CK.Acylated flavonol monorhamnosides，α-glucosidase inhibitors，from Machilus philippinensis.Phytochemistry，2008，69:2347-2353.

10 Kang WY(康文藝)，Zhang L(張麗)，Song YL(宋艷麗).α-Glucosidase inhibitors from Rubia cordifolia.Chin J Chni Mater Med(中國中藥雜志)，2009，34:1104-1107.

11 Kang WY(康文藝)，Wang JM(王金梅)，Zhang L(張麗).α-Glucosidase inhibitors from leaves of Forsythia suspense in Henan province.Chin J Chi Mat Med(中國中藥雜志)，2010，35:1156-1159.

12 Hu FL，Deng CH，Zhang XM.Development of high performance liquid chromatogratography with immobilized enzyme onto magnetic nanospheres for screening enzyme inhibitor.J Chromatogr B，2008，871:67-71.

13 Zhu WJ(朱文佳).Studies on the inhibitory effects of active component from TCM on α-glucosidase.Dalian Polytechnic University(大連工業(yè)大學(xué))，MD.2010.

14 Gu JP(顧江萍)，Liang XM(梁鑫淼).Study on inhibition of the Chinese herbal medicines on α-glucosidase.J Chin Model TCM(中華現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)雜志)，2005，1:116-118.

15 Lin YX(林岳賢).Bioactive Components Isolated from the Leaves of Cinnamomum osmophloeum Kanehira.Taiwan:National Chung Hsing University(國立中興大學(xué))，MD.2008.

16 Kang WY(康文藝)，Zhang L(張麗)，Song YL(宋艷麗).α-Glucosidase inhibitors from Luculia pinciana.Chin J Chi Mat Med(中國中藥雜志)，2009，34:406-409.

17 Wang JY(王鏡巖)，Zhu SG(朱圣庚)，Xu CF(徐長發(fā)).Biochemistry(生物化學(xué)).Beijing:Higher Education Press，2002.371.