海兔素對(duì)人乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制研究

馬文龍，梁 惠，劉 穎

1陜西省楊凌示范區(qū)醫(yī)院，楊凌712100;2青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青島266021

表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)的自體磷酸化及其對(duì)下游Akt和ERK等效應(yīng)分子的活化作用，在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化過程中發(fā)揮重要作用。近年來，尋找阻斷EGFR細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的藥物，成為人們進(jìn)行抗癌藥物研究的熱點(diǎn)。隨著海洋抗腫瘤活性物質(zhì)的不斷開發(fā)利用，海藻萜類化合物因其結(jié)構(gòu)獨(dú)特、生物活性強(qiáng)，日益引起人們的廣泛關(guān)注［1］。研究表明，很多萜類化合物對(duì)乳腺癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌等多種腫瘤細(xì)胞都具有良好的抑制作用［2-4］。三列凹頂藻(Laurencia tristicha)屬紅藻門(Rhodophyta)，紅藻綱(Rhodophyceae)，仙菜目(Ceramiales)，松節(jié)藻科(Rhodomelaceae)，凹頂藻屬(Laurencia)，是海洋萜類化合物的重要來源。海兔素(Aplysin)是存在于三列凹頂藻中的一種溴代倍半萜類化合物，本課題組前期從三列凹頂藻中提取純化了海兔素，并對(duì)乳腺癌的抑制作用進(jìn)行了體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，海兔素可明顯抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖，并顯著抑制細(xì)胞中VEGF表達(dá);動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明，海兔素?zé)o毒副作用，使用安全，可有效抑制二甲基苯蒽誘導(dǎo)的乳腺癌腫瘤組織中VEGF的表達(dá)，且具有量效依賴性［5］。但關(guān)于從阻斷細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路方面闡述海兔素抑瘤機(jī)制的研究較少，國(guó)內(nèi)外也未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以海兔素為干預(yù)物，觀察其對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并通過EGFR信號(hào)通路，進(jìn)一步探討海兔素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 溴代倍半萜海兔素的制備

三列凹頂藻由中國(guó)科學(xué)院海洋研究所提供并鑒定。由青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)營(yíng)養(yǎng)研究所將常溫風(fēng)干的海藻樣品(5 kg)，用體積分?jǐn)?shù)為0.95的乙醇室溫浸泡3 d，提取3次，提取液減壓濃縮(溫度低于40℃)得乙醇提取物325 g;然后將乙醇提取物懸浮于蒸餾水中，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相回收溶劑得萃取物105 g。取乙酸乙酯萃取物，干法上樣，進(jìn)行正相硅膠柱色譜分離，用石油醚丙酮梯度洗脫，薄層色譜檢查，合并相同部分。洗脫液經(jīng)過反復(fù)正相硅膠、生物膠Bio-beads、凝膠Sephadex LH-20柱色譜和反相HPLC分離純化，得到一白色化合物，經(jīng) IR、13C-及1H NMR鑒定此化合物為溴代倍半萜海兔素單體(Aplysin)，分子式為C15H19OBr，分子量為295。

1.2 細(xì)胞株、主要試劑及儀器

人乳腺癌細(xì)胞 SK-BR-3，為本實(shí)驗(yàn)室所有。DMEM/F12培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司;Cell Counting Kit-8試劑盒購(gòu)自日本Dojindo公司;Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD Pharmingen公司;蛋白裂解液(PRO-PREPTM Protein Extraction Solution)由韓國(guó) iNtRON Biotechnology公司生產(chǎn);蛋白檢測(cè)試劑盒(Bio-Rad Protein Assay)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;羊抗人GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，二抗購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司;EGFR、phospho-EGRF、Akt、phosphor-Akt、ERK、Phospho-ERK兔抗人抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，其相應(yīng)的二抗均購(gòu)于美國(guó)ZYMED公司;化學(xué)發(fā)光試劑盒(chemiluminescence detection kit)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;流式細(xì)胞儀為Beckman Coulter公司制造;酶標(biāo)儀為Thermo公司制造;膠片沖洗機(jī)(CP1000型)為德國(guó)AGFA-Gevaert NV公司制造。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及海兔素貯存液的配制

乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞用DMEM/F12全培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)為0.1的胎牛血清)，于37℃，5%CO2水汽培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。隔天換液一次，三天傳代一次，收集指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。海兔素以二甲亞砜(DMSO)助溶，使用時(shí)用DMEM/F12全培養(yǎng)液稀釋至終濃度，所有處理組DMSO終濃度體積分?jǐn)?shù)均為0.001(實(shí)驗(yàn)證實(shí)該濃度對(duì)細(xì)胞無明顯損害)。

1.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)海兔素對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響

收集指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按2×104/孔接種于96孔板。培養(yǎng)24 h后，實(shí)驗(yàn)組加入藥物終濃度分別為10、20、30、40、45、50、55、60 mg/L的培養(yǎng)液;對(duì)照組加入含等體積PBS的培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸棄上清，每孔加入100 μL新鮮培養(yǎng)液及10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，于酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定各孔OD值，OD值的大小與細(xì)胞活性呈正相關(guān)。以SPSS 11.5軟件計(jì)算IC25和IC50，抑制率=(OD對(duì)照組-OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組)× 100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞經(jīng) IC25和 IC50劑量海兔素(29.4和33.7 mg/L)處理24 h后，用胰酶常規(guī)消化并收集細(xì)胞。以預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，用1×緩沖液調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，然后吸取100 μL細(xì)胞懸液于流式細(xì)胞儀專用分析試管中，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI溶液，輕輕吹打均勻，置于室溫，避光孵育15 min。加入400 μL 1×緩沖液，通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。以正常未染色細(xì)胞對(duì)儀器進(jìn)行調(diào)試，分別以FITC Annextin V和PI單染細(xì)胞進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)和正常與凋亡細(xì)胞象限的界定，數(shù)據(jù)經(jīng)WinMDI2.9軟件分析，總凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)等于中晚期凋亡細(xì)胞(Annexin VFITC+/PI+)與早期凋亡細(xì)胞(Annexin V-FITC+/ PI－)百分?jǐn)?shù)之和。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.6 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中EGFR、Akt及ERK的總蛋白和磷酸化蛋白相對(duì)表達(dá)水平

指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞經(jīng) IC25和 IC50劑量海兔素(29.4和33.7 mg/L)處理24 h后，用胰酶常規(guī)消化并收集細(xì)胞。以預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，每管加入150 μL細(xì)胞裂解液和10 μL磷酸酶抑制劑，在冰上裂解30 min，4℃12000 rpm，離心15 min，收集上清液，用蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)樣品與上樣buffer混合后，沸水中煮沸10 min。每孔上樣10 μg，經(jīng)4%～12%SDS-PAGE分離樣品后，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，以封閉液(5%脫脂奶粉，溶于TBS)室溫封閉1 h。將膜與溶于抗體稀釋液(5%脫脂奶粉，溶于PBS-T)中的一抗(GAPDH抗體1∶1000、EGFR抗體1∶1000，phospho-EGRF抗體1∶1000、ERK抗體1∶1000、phospho-ERK抗體1∶1000、Akt抗體1∶1000、phosphor-Akt抗體1∶1000)封于塑膠袋中，4℃搖晃孵育過夜。PBS-T洗脫5次，每次5 min，將膜與溶于抗體稀釋液的二抗室溫孵育1 h，PBS-T洗脫5次，每次5 min。采用化學(xué)發(fā)光試劑盒，對(duì)膜進(jìn)行暗室曝光后，經(jīng)膠片沖洗機(jī)顯影，定影后，結(jié)果經(jīng)掃描后輸入計(jì)算機(jī)，經(jīng)IMAGE-J軟件進(jìn)行圖像分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，多組比較采用單因素方差分析，P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 海兔素對(duì)SK-BR-3細(xì)胞增殖的影響

CCK-8結(jié)果顯示，經(jīng)海兔素處理24 h后，對(duì)SKBR-3細(xì)胞的增殖具有抑制作用，且呈劑量依賴性。其中，10 mg/L海兔素組與對(duì)照組比較，無顯著性差異(P＞0.05)，其余各藥物組與對(duì)照組比較以及藥物組之間比較，均表現(xiàn)出顯著性差異(P＜0.05)。藥物濃度越高，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用也越明顯，當(dāng)海兔素劑量達(dá)到55 mg/L時(shí)，99%以上的細(xì)胞已經(jīng)死亡(Table 1、Fig 1)。以SK-BR-3細(xì)胞OD值對(duì)藥液濃度值作藥物量效的線性回歸分析顯示，兩者間存在線性關(guān)系，給藥濃度與細(xì)胞OD值呈負(fù)相關(guān)(y =-0.04x+2.39，r=0.96，P＜0.05，x為藥液濃度，y為SK-BR-3細(xì)胞的OD值)。計(jì)算出海兔素作用SK-BR-3細(xì)胞24 h的IC25和IC50值為分別為29.4和33.7 mg/L。

表1 海兔素對(duì)SK-BR-3細(xì)胞增殖的影響Table 1 The effects of Aplysin on the proliferation of SK-BR-3 cell(n=4，±s)

表1 海兔素對(duì)SK-BR-3細(xì)胞增殖的影響Table 1 The effects of Aplysin on the proliferation of SK-BR-3 cell(n=4，±s)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05;與10 mg/L組比較，▲P＜0.05;與20 mg/L組比較，△P＜0.05;與30 mg/L組比較，★P＜0.05;與40 mg/L組比較，☆P＜0.05;與45mg/L組比較，※P＜0.05;與50 mg/L組比較，#P＜0.05。Note:Compare with control，*P＜0.05;Compare with 10 mg/Lgroup，▲P＜0.05;Compare with 20 mg/L group，△P＜0.05;Compare with 30 mg/ Lgroup，★P＜0.05;Compare with 40 mg/L group，☆P＜0.05;Compare with 45 mg/L group，※P＜0.05;Compare with 50 mg/Lgroup，#P＜0.05.

組別Group 劑量Dose(mg/L)吸光度值OD450nm抑制率Inhibition ratio(%) 25%抑制劑量IC25(mg/L) 50%抑制劑量IC50(mg/L) Control － 2.062±0.026 0.00 29.4 33.7海兔素Aplysin 10.00 2.057±0.026 0.24對(duì)照組99.17 20.00 1.903±0.072＊▲ 7.71 30.00 1.397±0.107＊▲△ 32.25 40.00 0.576±0.119＊▲△★ 72.06 45.00 0.170±0.015＊▲△★☆ 91.75 50.00 0.050±0.018＊▲△★☆※ 97.57 55.00 0.017±0.001＊▲△★☆※# 99.17 60.00 0.017±0.004＊▲△★☆※#

圖1 海兔素對(duì)SK-BR-3細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effects of aplysin on proliferation of SK-BR-3 cells

2.2 海兔素對(duì)SK-BR-3細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，SK-BR-3細(xì)胞經(jīng)IC25和IC50劑量的海兔素處理24 h后，可分析得到明顯的凋亡細(xì)胞(包括早期凋亡細(xì)胞和中晚期凋亡細(xì)胞)，IC25和IC50藥物處理組的細(xì)胞凋亡率分別是(16.7±1.4)%和(58.3±2.4)%，明顯高于正常對(duì)照組凋亡率(0±1.2)% ，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，有顯著性差異(P＜0.05)，見Fig.2。

圖2 海兔素劑量依賴性誘導(dǎo)SK-BR-3細(xì)胞凋亡Fig.2 Dose-dependent apoptosis in SK-BR-3 cells induced by aplysin

2.3 海兔素對(duì)SK-BR-3細(xì)胞中EGFR總蛋白和磷酸化蛋白相對(duì)表達(dá)水平的影響

結(jié)果顯示，經(jīng)IC25和IC50劑量海兔素處理SKBR-3細(xì)胞24 h后，細(xì)胞中EGFR總蛋白表達(dá)水平未見明顯降低，與對(duì)照組比較，無顯著性差異(P＞0.05);而EGFR磷酸化蛋白的表達(dá)則明顯受到抑制，且隨著藥物濃度的增大，表達(dá)水平逐漸降低，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較及實(shí)驗(yàn)組間比較，差異均具有顯著性(P＜0.05)，見Fig.3。

圖3 海兔素對(duì)SK-BR-3細(xì)胞EGFR總蛋白和磷酸化蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of aplysin on the expression of phosphorylated and total EGFR in SK-BR-3 cells

2.4 海兔素對(duì)SK-BR-3細(xì)胞中ERK和Akt總蛋白和磷酸化蛋白相對(duì)表達(dá)水平的影響

結(jié)果顯示，經(jīng)IC25和IC50劑量海兔素處理SKBR-3細(xì)胞24 h后，細(xì)胞中ERK和Akt總蛋白表達(dá)水平均未見明顯降低，與對(duì)照組比較，無顯著性差異(P＞0.05);而ERK和Akt磷酸化蛋白的表達(dá)均明顯受到抑制，且隨著藥物濃度的增大，表達(dá)水平均逐漸降低，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較及實(shí)驗(yàn)組間比較，差異均具有顯著性(P＜0.05)，見Fig.4和Fig.5。

3 討論

腫瘤是一種多基因異常性疾病，其發(fā)病涉及多種原癌基因和抑癌基因的結(jié)構(gòu)和功能異常。原癌基因異常激活和過表達(dá)，會(huì)引起相應(yīng)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控紊亂，使細(xì)胞失去正常生長(zhǎng)調(diào)控，出現(xiàn)無限增殖和凋亡抑制，從而導(dǎo)致腫瘤形成。EGFR是c-(erbB)-1原癌基因編碼的170 kD跨膜糖蛋白，EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在腫瘤細(xì)胞增殖、損傷修復(fù)、侵襲及新生血管形成等方面起重要作用。EGFR活化可激活多種下游信號(hào)途徑，產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)。本課題組研究表明，海兔素是一種安全低毒的天然抗腫瘤活性物質(zhì)，可抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，但其具體機(jī)制尚不明了［6-7］。本研究選擇與調(diào)控細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的蛋白EGFR及其下游效應(yīng)分子ERK和Akt，檢測(cè)其表達(dá)情況，以探討海兔素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。本文證實(shí)了海兔素可以通過阻斷EGRF/ERK和EGFR/Akt信號(hào)通路，抑制人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3增殖并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。

本實(shí)驗(yàn)中，CCK-8結(jié)果顯示，海兔素能抑制乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3的增殖，呈劑量依賴性。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，海兔素可誘導(dǎo)SK-BR-3細(xì)胞凋亡，且隨藥物劑量增加，細(xì)胞凋亡率明顯提高，其中，IC50劑量海兔素可誘導(dǎo)相當(dāng)高比例的SK-BR-3細(xì)胞凋亡，凋亡率達(dá)到(58.3±2.4)%，表明海兔素能通過抑制SK-BR-3細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，最終抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)Western blot檢測(cè)還發(fā)現(xiàn)，海兔素雖不能抑制膜受體蛋白EGFR及其下游效應(yīng)分子ERK和Akt總蛋白的表達(dá)，但可顯著抑制EGFR蛋白磷酸化水平，并使下游效應(yīng)分子ERK和Akt的激活明顯受到影響，且隨著藥物濃度增加，EGFR、ERK和Akt的磷酸化水平均顯著下降，呈量效依賴性。EGFR受體及其下游效應(yīng)分子是腫瘤細(xì)胞增殖過程中的重要調(diào)節(jié)因子［8，9］，EGRF與其配體相結(jié)合后，發(fā)生二聚化和自體磷酸化，進(jìn)而激活下游的PI3K/ AKT和(或)RAS/MAPK信號(hào)通路，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖［10，11］。EGFR受體被激活后，經(jīng)細(xì)胞質(zhì)中各種銜接蛋白酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，將信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)。其中，最主要的信號(hào)通路包括MAPK通路，PI3K通路和c-Src通路。ERK1/2是MAPK通路中重要的成員之一，EGFR近膜信號(hào)發(fā)生后，可誘導(dǎo)絲氨酸/蘇氨酸酶Raf和ERK1/2激酶特異性地激活ERK1/2，最終通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、cfos等，提高相關(guān)基因表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的增殖［12］。Akt是PI3K信號(hào)通路下游一個(gè)重要的靶分子，當(dāng) EGFR與配體結(jié)合被激活后，其下游分子Gab1被磷酸化，作為船塢蛋白招募大量的下游信號(hào)蛋白，特別是PI3K和Akt，這兩種效應(yīng)分子可通過刺激大量相關(guān)蛋白(如調(diào)節(jié)FasL表達(dá)的Forkhead家族轉(zhuǎn)錄因子、caspase-9、GSK-3β、NF-κB等)的磷酸化來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。由于EGFR蛋白必須與配體結(jié)合才能發(fā)生自體磷酸化，以激活下游效應(yīng)分子，因此，本研究提示，海兔素抑制EGFR蛋白磷酸化的機(jī)制，可能是其阻斷了EGFR與相應(yīng)配體的結(jié)合，這一發(fā)現(xiàn)為海兔素對(duì)乳腺癌治療作用的研究提供了一定的理論依據(jù)，本課題將對(duì)此進(jìn)行進(jìn)一步的深入探討。

綜上所述，海兔素可有效抑制乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，作為一種抗腫瘤海洋天然活性物質(zhì)，值得進(jìn)一步開發(fā)利用和深入探索。

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