猴頭菌子實(shí)體化學(xué)成分研究

麻兵繼，徐俊蕾，文春南，于海尤，李 文，阮 元，申進(jìn)文，馬進(jìn)川

1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院中藥材系;2河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院微生物系，鄭州450002

猴頭菌(Hericium erinaceus)因子實(shí)體形狀酷似猴子的頭而得名，在分類學(xué)上，猴頭菌屬于擔(dān)子菌門、猴頭菌科、猴頭菌屬，是著名的藥食兼用真菌。據(jù)《中國藥用真菌》記載，猴頭菌性平，味甘，能利五臟，助消化，滋補(bǔ)，抗癌，治療神經(jīng)衰弱。國內(nèi)已經(jīng)廣泛用于治療消化不良、胃潰瘍、食道癌、胃癌、十二指腸癌、賁門癌等消化系統(tǒng)疾病［1］。近年來國內(nèi)外學(xué)者先后從猴頭菌液體發(fā)酵菌絲中分離鑒定了erinacines A-R等共24個具有新奇結(jié)構(gòu)的鳥巢烷型二萜(cyathins)［2］。

猴頭菌子實(shí)體的化學(xué)成分文獻(xiàn)報導(dǎo)有:脂肪酸、甾體、多糖及 hericenones A-H、erinacerins A和 B、hericenone I、hericene D等酚性化合物［3，4］。文獻(xiàn)報導(dǎo)hericenones類化合物在33 μg/mL的濃度下有促進(jìn)神經(jīng)生長因子合成的活性［5］。以后的研究一般也把hericenones類化合物作為猴頭菌子實(shí)體促進(jìn)神經(jīng)生長因子合成的活性成分。最近，日本Nakahata研究組發(fā)表的文章也表明猴頭菌子實(shí)體有顯著促進(jìn)神經(jīng)生長因子合成的活性，但他們的研究結(jié)果提出hericenones類化合物不是猴頭菌子實(shí)體促進(jìn)神經(jīng)生長因子合成的活性成分［6］。其理由有兩點(diǎn): (1)hericenones類化合物在猴頭菌子實(shí)體中的含量很低，相當(dāng)于每100 μg/mL的猴頭菌子實(shí)體乙醇提取液中只含有20 ng/mL的hericenone C、4 ng/mL的hericenone D、2 ng/mL的hericenone E，遠(yuǎn)達(dá)不到文獻(xiàn)報導(dǎo)的33 μg/mL有效濃度。(2)即使以100 μg/mL的高濃度hericenone C、D、E三個單體化合物刺激人1321N1星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌神經(jīng)生長因子，測定細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)生長因子mRNA表達(dá)量，Nakahata研究組實(shí)驗(yàn)也沒有發(fā)現(xiàn)hericenones類物質(zhì)有顯著促進(jìn)神經(jīng)生長因子基因表達(dá)的作用。

基于猴頭菌子實(shí)體有顯著的神經(jīng)生長因子合成活性但活性成分尚不明確的現(xiàn)狀，為了盡可能多地發(fā)現(xiàn)猴頭菌中的次生代謝產(chǎn)物，我們對猴頭菌子實(shí)體進(jìn)行了化學(xué)成分的研究，為猴頭菌這一寶貴真菌資源在今后防治老年性癡呆等疾病方面的深入開發(fā)提供一些思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

XRC-1型顯微熔點(diǎn)儀為四川大學(xué)科儀廠生產(chǎn)，溫度計未校正;JASCO-20旋光儀;VG AutoSpec-3000質(zhì)譜儀;核磁共振測定用 Bruker AM-400和Bruker AM-500，TMS為內(nèi)標(biāo)。層析材料和薄層層析材料由青島海洋化工廠生產(chǎn);Sephadex LH-20為Merck公司產(chǎn)品。麥角甾-5，7，22-三烯-3β-醇和5α，8α-過氧化麥角甾-6，22-二烯-3β-醇對照品由本實(shí)驗(yàn)室自制，純度超過95%。

猴頭菌于2009年7月購自鄭州調(diào)味品市場，標(biāo)本由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)申進(jìn)文教授鑒定為H.erinaceus，標(biāo)本(200907009)存于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院中藥材系標(biāo)本室。

1.2 提取與分離

1000 g干燥的猴頭菌子實(shí)體經(jīng)粉碎后用10 L甲醇(2×5 L)室溫浸泡12 h，過濾，合并提取液減壓回收溶劑得到浸膏約90 g。樣品經(jīng)硅膠拌樣后上200～300目硅膠柱分離，以氯仿-甲醇系統(tǒng)梯度(100∶0～70∶30)洗脫，每300 mL收集一次。氯仿-甲醇(80∶20)部分經(jīng)重結(jié)晶得到化合物1(1.7 g)。氯仿-甲醇(70∶30)部分經(jīng)重結(jié)晶得到化合物2(2.5 g)。氯仿-甲醇(90∶10)部分經(jīng)反復(fù)柱層析得到化合物3(475 mg)。純氯仿洗脫部分流份49～69合并后繼續(xù)上硅膠柱分離，以石油醚-丙酮梯度(100∶10～90∶10)洗脫分別得到化合物4(60 mg)和5(650 mg)。純氯仿洗脫部分流份12～35合并后繼續(xù)上硅膠柱分離，以石油醚-乙酸乙酯梯度(100∶10～80∶20)洗脫分別得到化合物6和7的混合物(810 mg)和8、9和10的混合物。8、9和10的混合物經(jīng)凝膠Sephadex LH-20純化(氯仿-甲醇1∶1，v/v)分別得到化合物8(316 mg)、9(120 mg)和10(103 mg)。氯仿洗脫部分流份3-5合并后再以凝膠Sephadex LH-20純化(氯仿-甲醇1∶1，v/v)得到化合物11(782 mg)。

2 化學(xué)結(jié)構(gòu)及鑒定

化合物1 D-赤蘚糖醇，C4H10O4，無色方晶(甲醇)，mp.58℃。FAB--MS m/z(%):121［M-1］-(100)。1H NMR(D2O，400 MHz)δ:3.48～3.56 (m，H-2，3)，3.64(d，J=12.0 Hz，H-1，4)。13C NMR (D2O，100 MHz)δ:71.8(C-2，3)，62.5(C-1，4)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)值符合［7］。

化合物2 D-阿拉伯糖醇，C5H12O5，無色方晶(甲醇)，mp.106℃。FAB--MS m/z(%):151［M -1］-(100)。1H NMR(D2O，400 MHz)δ:3.43 (1H，d，J=8.0 Hz)，3.45(1H，d，J=4.0 Hz)，3.53 (1H，s)，3.60(1H，s)，3.69(1H，d，J=4.0 Hz)，3.72(1H，d，J=4.0 Hz)，3.80(1H，m)。13C NMR (D2O，400 MHz)δ:70.8(C-3)，70.4(C-2)，70.2(C-4)，62.9(C-1)，62.9(C-5)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)值符合［7］。

化合物3 1-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(2S，4E，8E，2'R)-2-N-(2'-羥基十六烷酰)-9-甲基-4，8-sphingadienine，C41H77NO8，白色無定型粉末(甲醇)。FAB--MS m/z(%):710［M-1］-(100)。1H NMR (D2O，400 MHz)δ:3.87(2H，m，H-1)，4.09(1H，m，H-2)，2.08(2H，m，H-3)，5.78(1H，m，H-4)，5.74 (1H，m，H-5)，2.04(2H，m，H-6)，2.04(2H，m，H-7)，5.46(1H，m，H-8)，1.97(2H，m，H-10)，1.68 (2H，m，H-11)，1.38(8H，br.s，H-12-15)，0.94(3H，t，6.4Hz，H-16)，1.64(3H，s，H-17)，4.54(1H，m，H-2')，1.32(22H，br.s，H-2'-12')，1.24(2H，m，H-15')，0.94(3H，t，6.4Hz，H-16')，5.10(1H，m，H-1'')，3.34(1H，m，H-2'')，4.44(1H，m，H-3'')，4.40 (1H，m，H-4'')，3.54(1H，m，H-5'')，3.24(2H，m，H-6'')，7.50(1H，s，-NH)。13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:61.4(C-1)，54.4(C-2)，39.8(C-3)，128.6 (C-4)，136(C-5)，34.7(C-6)，32.1(C-7)，123.1 (C-8)，134.6(C-9)，32.7(C-10)，30.1(C-11)，29.9-29.8(C-12-15)，30.0(C-16)，25.4(C-17)，14.1(C-18)，16.1(C-19)，176.4(C-1')，72.4(C-2')，29.7-29.5(C-3'-13')，27.7(C-14')，22.7(C-15')，16.0(C-16')，103.0(C-1'')，76.1(C-2'')，77.0(C-3'')，72.4(C-4'')，77.3(C-5'')，61.0(C-6'')。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)值符合［8］。

化合物4 麥角甾-5，7，22-三烯-3β-醇，C28H44O，無色針晶(氯仿)，mp.152～154℃，［α=-129° (c=0.22，CHCl3)，EI-MS m/z(%):396(［M］+，80)，378(21)，271(55)，253(43)，55(100)。與對照品對照一致。

化合物 5 5α，8α-過氧化麥角甾-6，22-二烯-3β-醇，C28H44O3，無色針晶(氯仿)，mp.177～178℃，［α= +20°(c=0.1，氯仿)。EI-MS m/z (%):428(［M］+，10)，410(10)，396(40)，363 (35)，251(85)，55(100)。與對照品一致。

化合物6和7 為一組硬脂酸、油酸的混合物，C18H36O2、C18H34O2，無色油狀物。EI-MS m/z(%): 284，282，241，185，171，143，129。13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ:180.3(COOH)，130.0(C-9)，129.7(C-10)，29.8(C-2)，29.7-22.7(C-3-17)，14.1(C-18)。在質(zhì)譜中可見兩個明顯的分子離子峰284和282，在碳譜中可見脂肪酸的羧基碳、末段甲基以及兩個雙鍵碳信號，提示是一個飽和脂肪酸與一個不飽和脂肪酸的混合物。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)值一致［7］。

化合物8 hericenone F，C35H54O6，淡黃色油狀物。FAB+-MS m/z(%):571［M+1］+(100)。1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:2.0(1H，m，H-3a)，1.91 (1H，m，H-3b)，2.64(2H，dd，J=6.6，6.6 Hz，H-4)，6.55(1H，s，H-6)，10.41(1H，s，CHO)，1.44(3H，s，2-CH3)，5.51(2H，s，7-CH2)，3.88(3H，s，OCH3)，2.82(1H，d，J=13.9 Hz，H-1'a)，2.66(1H，d，J= 13.9 Hz，H-1'b)，6.06(1H，s，H-3')，2.14(3H，s，4'-CH3)1.86(3H，s，H-5')，2.41(2H，d，J=7.3 Hz，H-2'')，1.69(2H，m，H-3'')，1.25(m，H-4''-15'')，0.88(3H，m，H-16'')。13C NMR(CDCl3，100 MHz) δ:76.9(C-2)，30.1(C-3)，16.5(C-4)，109.2(C-4a)，161.9(C-5)，100.8(C-6)，139.7(C-7)，115.8 (C-8)，158.3(C-8a)，24.5(2-CH3)，52.4(C-1')，197.9(C-2')，125.0(C-3')，156.4(C-4')，20.8(4-CH3)，27.8(C-5')，190.4(CHO)，55.6(OCH3)，64.5(7'-CH2)，173.3(C-1'')，34.4(C-2'')，22.7～32.0(C-3''-15'')，14.1(C-16'')。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)值一致［10］。

化合物9 hericenone C，C35H54O6，無色油狀物。FAB+-MS m/z(%):571［M+1］+(100)。1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:6.53(1H，s，H-6)，5.32 (2H，s，H-1-CH2)，10.11(1H，s，CHO)，3.91(3H，s，OCH3)，3.40(2H，d，J=7.3 Hz，H-1')，5.32(1H，d，J=7.3 Hz，H-2')，3.01(2H，s，H-4')，6.09(1H，s，H-6')，1.84(3H，s，H-8')，1.78(3H，s，H-3'-CH3) 2.12(3H，s，H-7'-CH3)，2.33(2H，dd，J=7.7，7.3 Hz，H-2'')，1.61(2H，m，H-3'')，1.25(m，H-4''-17'')，0.88(3H，m，H-18'')。13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ:199.5(C-5')，193.1(CHO)，173.2(C-1'')，163.5(C-5)，162.9(C-3)，155.5(C-7')，138.7(C-1)，130.3(C-3')，126.3(C-2')，122.8(C-6')，117.3 (C-4)，112.9(C-2)，105.5(C-6)，62.9(C-1-CH2-)，55.9(OCH3)，55.6(C-4')，34.2(C-2'')，27.7(C-8')，21.6(C-1')，20.7(7'-CH3)，16.4(3'-CH3)，22.7～32.0(C-3''-15'')，14.3(C-16'')。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)值一致［5］。

化合物10 hericenone E，C37H54O6，無色油狀物。FAB+-MS m/z(%):595［M+1］+(100)。1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:6.53(1H，s，H-6)，5.32 (2H，s，H-1-CH2)，10.11(1H，s，CHO)，3.91(3H，s，OCH3)，3.40(2H，d，J=7.3 Hz，H-1')，5.32(1H，d，J=7.3 Hz，H-2')，3.01(2H，s，H-4')，6.09(1H，s，H-6')，1.84(3H，s，H-8')，1.78(3H，s，H-3'-CH3) 2.12(3H，s，H-7'-CH3)2.33(2H，dd，J=7.7，7.3 Hz，H-2'')，1.62(2H，m，H-3'')，2.78(m，H-11'')，2.04(4H，m，H-8''，14'')，1.62(4H，m，H-7''，15'')，5.34(4H，m，H-9''，10''，12''，13'')，0.86 (3H，t，H-18'')。13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ: 199.5(C-5')，193.1(CHO)，173.1(C-1'')，163.5 (C-5)，162.9(C-3)，155.4(C-7')，138.7(C-1)，130.3(C-3')，130.2，129.9，128.1，127.9(C-9''，10''，12''，13'')126.3(C-2')，122.8(C-6')，117.3 (C-4)，112.9(C-2)，105.6(C-6)，62.9(C-1-CH2)，55.9(OCH3)，55.6(C-4')，34.2(C-2'')，27.7(C-8')，21.6(C-1')，20.6(7'-CH3)，16.4(3'-CH3)，22.7～32.0(C-3''-8''，11''，14''-17'')，14.1(C-18'')。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)值一致［5］。

化合物11 hericene A，C35H56O5，無色油狀物。FAB+-MS m/z(%):557［M+1］+(100)。1H NMR (CDCl3，400 MHz)δ:6.52(1H，s，H-6)，5.32(2H，s，H-7)，10.10(1H，s，CHO)，3.91(3H，s，H-9)，3.34(2H，d，J=7.0 Hz，H-1')，5.17(1H，d，J=7.0 Hz，H-2')，1.97(2H，m，H-4')，2.03(2H，m，H-5')，5.05(1H，m，H-6')，1.63(3H，s，H-8')，1.60(3H，s，H-9')1.77(3H，s，H-10')。13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ:138.4(C-1)，112.9(C-2)，162.9(C-3)，118.1(C-4)，163.5(C-5)，105.6(C-6)，62.9(C-7)，193.1(C-8)，55.9(C-9)，21.4(C-1')，121.2(C-2')，131.2(C-3')，39.8(C-4')，26.7(C-5')，124.4 (C-6')，135.7(C-7')，26.7(C-8')，17.6(C-9')， 16.1(C-10')，173.2(C-1'')，34.2(C-2'')，25.1～32.0(C-3''-15'')，14.1(C-16'')。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)值一致［11］。

化合物3、8～11的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示:

圖1 化合物3、8～11的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of compounds 3 and 8-11

3 討論

本研究利用柱色譜技術(shù)從猴頭菌干燥子實(shí)體的甲醇提取物中分離得到11個化合物，經(jīng)光譜技術(shù)分別鑒定為:D-赤蘚糖醇(1)、D-阿拉伯糖醇(2)、1-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(2S，4E，8E，2'R)-2-N-(2'-羥基十六烷酰)-9-甲基-4，8-sphingadienine(3)、3β-羥基-麥角甾-5，7，22-三烯(4)、3β-羥基-5α，8α-過氧化麥角甾-6，22-二烯(5)、硬脂酸(6)、油酸(7)、hericenone F(8)、hericenone C(9)、hericenone E(10)和hericene A(11)。從次生代謝產(chǎn)物來看，hericenones型酚類物質(zhì)在猴頭菌子實(shí)體中含量豐富，四個hericenones類物質(zhì)的總含量達(dá)到子實(shí)體干重的0.13%。對于Nakahata研究組提出的hericenones類化合物不是猴頭菌子實(shí)體促進(jìn)神經(jīng)生長因子合成的活性成分的觀點(diǎn)，我們認(rèn)為有值得商榷的地方。我們的研究結(jié)果表明，hericenone F和hericene A是猴頭菌子實(shí)體中含量最高的兩個hericenones類化合物。Nakahata研究組以含量較低的hericenone C、hericenone D和hericenone E來測定1321N1星形膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)生長因子mRNA表達(dá)量，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能完全代表整類hericenones化合物的生物活性，hericenones類化合物的構(gòu)效關(guān)系更是缺乏研究。另外，hericenones類化合物水溶性極差，Nakahata研究組在做相關(guān)生物活性測試實(shí)驗(yàn)時以生理鹽水作為溶媒，其真正的藥物濃度遠(yuǎn)達(dá)不到文獻(xiàn)中所描述的100 μg/mL的高濃度。

雖有鳥巢烷型二萜陸續(xù)從猴頭菌液體發(fā)酵菌絲中報道［12］，但我們在實(shí)驗(yàn)中沒有從猴頭菌子實(shí)體中發(fā)現(xiàn)此類成分，推測是該類成分的生物合成關(guān)鍵酶在子實(shí)體生長過程中沒有被激發(fā)。另外，我們還從猴頭菌子實(shí)體中首次分離得到的腦酰胺類物質(zhì)1-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(2S，4E，8E，2'R)-2-N-(2'-羥基十六烷酰)-9-甲基-4，8-sphingadienine，是一個有意義的發(fā)現(xiàn)。近年來的研究表明，腦酰胺類物質(zhì)有廣泛的、重要的生理藥理作用［13］，部分腦酰胺類物質(zhì)很好的神經(jīng)保護(hù)作用，能顯著促進(jìn)神經(jīng)生長因子合成的生物活性［14］。因此，該類物質(zhì)也是值得關(guān)注的一類生物活性成分，為猴頭菌子實(shí)體中神經(jīng)保護(hù)作用的活性物質(zhì)的最終發(fā)現(xiàn)提供一種新的可能。

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