廣東夏大豆新品種（系）分子身份證的構(gòu)建

唐玉娟，宋恩亮，王梓鈺，馬啟彬，年 海

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/國家大豆改良中心廣東分中心，廣東 廣州 510642；2.廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530001；3.吉林省農(nóng)科院大豆研究所，吉林 長春 130033）

廣東夏大豆新品種（系）分子身份證的構(gòu)建

唐玉娟1，2，宋恩亮1，2，王梓鈺1，3，馬啟彬1，年 海1

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/國家大豆改良中心廣東分中心，廣東 廣州 510642；2.廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530001；3.吉林省農(nóng)科院大豆研究所，吉林 長春 130033）

建立快速簡便鑒定廣東夏大豆種質(zhì)資源的方法。對大豆20個連鎖群上的159對SSR引物進(jìn)行篩選，其中48對引物擴(kuò)增清晰、穩(wěn)定，用其檢測34份廣東夏大豆材料，將數(shù)字化后的等位變異片段用資源特征分析軟件ID Analysis 1.0進(jìn)行分析。結(jié)果表明，48對多態(tài)性引物平均等位變異數(shù)為3.88，平均基因多樣性指數(shù)為0.50，平均引物多態(tài)性信息含量（PIC）為0.45，可用于區(qū)分廣東夏大豆資源。僅需5對引物（Sat_267、Sat_235、Satt277、Sat_351 和Sat_292）可將全部34份種質(zhì)區(qū)分開，成功構(gòu)建了一套廣東夏大豆種質(zhì)的分子身份證。

夏大豆；分子身份證；SSR

唐玉娟，宋恩亮，王梓鈺，等.廣東夏大豆新品種（系）分子身份證的構(gòu)建［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（5）：37-41.

大豆起源于中國，是重要的糧食及油料作物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和國民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位［1-2］。目前，我國大豆育種過程中存在新種質(zhì)匱乏及骨干親本反復(fù)利用的情況，導(dǎo)致許多大豆育成品種遺傳基礎(chǔ)趨于狹窄，遺傳差異變小，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法越來越不適應(yīng)目前的育種工作［3-4］。以分子標(biāo)記為基礎(chǔ)的DNA指紋技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、簡單、不受環(huán)境條件影響的優(yōu)點，標(biāo)準(zhǔn)的DNA指紋圖譜庫一旦建立，就可以迅速地應(yīng)用于品種鑒定［5-6］。研究中常見的分子標(biāo)記包括AFLP、RFLP、SSR等。SSR標(biāo)記因其數(shù)量豐富、多態(tài)性高、表現(xiàn)穩(wěn)定、共顯性遺傳和操作簡便等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于植物新品種的鑒定與保護(hù)［7-8］。分子身份證（molecular ID）是國內(nèi)學(xué)者在DNA指紋圖譜的基礎(chǔ)上提出的一個概念，是鑒定種質(zhì)資源的一種新方法。這種方法利用資源特征分析軟件，對數(shù)字化編碼賦值的等位變異進(jìn)行分析，以最少的引物數(shù)對資源進(jìn)行區(qū)分，得到一組一定引物順序下的編碼組合，該編碼組合即代表了種質(zhì)間的差異，具有易于統(tǒng)計分析和長期保存的優(yōu)點［9］。

高運來等首次利用自主開發(fā)的資源特征分析軟件對43對SSR引物在83份黑龍江大豆品種中的變異進(jìn)行檢測，9對引物即可將全部材料區(qū)分開，建立了黑龍江部分大豆品種的分子身份證［10］。李偉忠等［11］選取優(yōu)良玉米自交系257份，用64對引物對其進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建了一套由10對引物組成的分子身份證。王黎明等［12］利用41對多態(tài)性引物擴(kuò)增來自6個國家的甜高粱種質(zhì)資源，成功構(gòu)建了10對引物組成的142份品種的分子身份證。馬琳等［13］通過分析33對SSR標(biāo)記在130份常見的甘藍(lán)型油菜品種中的等位變異，獲得了由7對引物組成的指紋圖譜，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了分子身份證。分子身份證的構(gòu)建不僅可以準(zhǔn)確區(qū)別和快速鑒定種質(zhì)資源，同時也是品種真?zhèn)舞b定和知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)的重要手段［14］。分子身份證的構(gòu)建技術(shù)已經(jīng)成熟，但目前尚未有針對廣東地區(qū)大豆種質(zhì)資源的相關(guān)研究報道。從覆蓋大豆20個連鎖群上的SSR引物中篩選得到擴(kuò)增清晰、穩(wěn)定的引物，通過分析以最少的引物組合將34份廣東夏大豆材料進(jìn)行區(qū)分。本研究以34份廣東夏大豆新品種（系）為試材，利用SSR分子標(biāo)記建立大豆分子身份證體系，以期為廣東夏大豆新品種（系）的分子鑒定提供快速簡便的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為34份廣東夏大豆品種（系），包括華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院國家大豆改良中心廣東分中心近年來育成品種8份（華夏1號、華夏2號、華夏3號、華夏4號、華夏5號、華夏6號、華夏9號、桂夏豆2號）、育種過程中篩選的優(yōu)良品系19份（V5、V6、V7、V10、V13、V14、V15、V16、V22、V23、V26、V27、V31、V32、V33、V35、V38、V46、V47）、巴西引進(jìn)品系3份（巴西3號、巴西8號、巴西13號）和廣東地區(qū)常用農(nóng)家種4份（連南黑臍、連南淺色臍、龍川青豆、英德黑豆）。

1.2 葉片總DNA提取與SSR標(biāo)記

葉片總DNA提取方法為SDS法，PCR反應(yīng)體系與擴(kuò)增條件參考曾巧英［15］方法并略加改進(jìn)，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測。從均勻分布于大豆公共遺傳圖譜的20個連鎖群上的159對引物中，篩選保留條帶清晰、差異明顯的48對SSR引物用于分析。引物由上海生物工程有限公司合成。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

引物等位位點數(shù)目、基因多樣性指數(shù)以及多態(tài)性信息含量（PIC）等一般統(tǒng)計量由PowerMarker V3.25軟件分析獲得。利用分析軟件Quantity One對比實驗中所加入的Marker的條帶大小，讀取48對引物在34份材料中的擴(kuò)增片段大小，以等位變異的大小為依據(jù)，對每對引物在34份材料中的擴(kuò)增片段進(jìn)行分型，分子量由大到小，依次為1、2、3、4 …… N統(tǒng)計數(shù)據(jù)（圖1）?；蚱蝸G失記為0，實驗操作造成缺失記為-1，雜合帶型記為-2。利用東北農(nóng)業(yè)大學(xué)開發(fā)的資源特征分析軟件ID Analysis 1.0（2007SR11870a）構(gòu)建廣東夏大豆資源分子ID。

圖1 Satt277等位基因特征

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)記等位基因信息分析

用159對引物對34份品種（系）進(jìn)行擴(kuò)增，保留其中多態(tài)性高且差異明顯的48對引物。利用PowerMarker V3.25進(jìn)行統(tǒng)計（表1），每對引物檢測到的等位位點數(shù)分布范圍為2～8個，共檢測到多態(tài)性片段186個，平均為3.88個；基因多樣性指數(shù)分布范圍為0.06～0.82，平均為0.50；引物多態(tài)性信息含量（PIC）變幅為0.06～0.80，平均為0.45。所用引物平均等位位點數(shù)較多，基因多樣性指數(shù)較高，可用于區(qū)分不同大豆品種（系），構(gòu)建廣東夏大豆新品種（系）的分子身份證。

2.2 廣東夏大豆分子身份證的構(gòu)建

分子身份證包括兩類，一類是以特異等位位點進(jìn)行區(qū)分，利用ID Analysis 1.0 對所篩選出的48對引物在34份種質(zhì)中的等位變異進(jìn)行分析，軟件剔除了缺失過多的3對引物（Sat_139、Sct_196、Satt462），保留的45對引物在34份大豆材料中共有32個特異等位位點（表2）。通過這些特異等位位點可以直接鑒定對應(yīng)的材料，如Satt277在材料V10中有特異條帶1，表示在Satt277各帶型中，有且只有V10表現(xiàn)為第1種帶型，可以據(jù)此為依據(jù)鑒定V10。以此類推，其他各特異位點均可用來鑒定對應(yīng)種質(zhì)。

特異等位位點可通過單一引物直接鑒定材料，但一般只存在于少量種質(zhì)中，更多的材料只能采用第二類方法，即用2對或2對以上的引物組合的差異位點來區(qū)分，當(dāng)2對引物不能完全區(qū)分所有材料時，就增加引物數(shù)直到所有材料可以區(qū)分開。利用ID Analysis 1.0對所篩選出的48對引物在34份材料中的帶型進(jìn)行分析，軟件在剔除了缺失過多的3對引物的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步剔除了與其他引物相似系數(shù)過高的Sat_224、Sat_287等21對引物，最終保留24對引物用于篩選引物組合，區(qū)分夏大豆種質(zhì)。結(jié)果表明，最少利用Sat_267、Sat_235、Satt277、Sat_351 和Sat_292共5對引物就可以將全部34份種質(zhì)區(qū)分開（表3），以V5為例，其ID 為26425，它表示這5對引物擴(kuò)增V5后得到的等位基因按照片段大小分別位于Sat_267的第2位、Sat_235的第6位、Satt277的第4位、Sat_351的第2位 和Sat_292的第5位，V5是34份材料中唯一具有這一等位位點組合的種質(zhì)，所以由這些引物等位基因所組成的字符串就可以代表V5的分子ID。

表1 引物擴(kuò)增等位位點數(shù)目、基因多樣性指數(shù)及多態(tài)信息含量

3 結(jié)論與討論

從覆蓋大豆20個連鎖群上的159對SSR引物中篩選出48對擴(kuò)增清晰、穩(wěn)定的引物，多態(tài)性引物平均等位變異數(shù)為3.88，平均基因多樣性指數(shù)為0.50，平均引物多態(tài)性信息含量（PIC）為0.45，可用于區(qū)分廣東夏大豆資源，利用其中的Sat_267、Sat_235、Satt277、Sat_351 和Sat_292共5對引物就可以將全部34份廣東夏大豆品種（系）區(qū)分開，構(gòu)建了一套廣東夏大豆分子身份證。

高運來等［10］在構(gòu)建黑龍江部分大豆分子身份證時發(fā)現(xiàn)，遺傳背景差異較大的品種分子身份證相差較大，而親緣關(guān)系較近的品種具有相似的分子身份證。從本研究的結(jié)果中可看到，華夏1號和華夏4號的分子身份證非常相近，分別為25422和25432，僅在第4對引物即Sat_351中存在差別，分析這兩個品種的來源，我們發(fā)現(xiàn)，華夏1號來源為桂早1號×巴西3號，華夏4號來源為桂早1 號×巴西8號，兩品種具有相同的母本，因此在Sat_351中的差異片段應(yīng)來源于父本巴西3號和巴西8號，從結(jié)果中可以看到兩種質(zhì)在Sat_351中的帶型分別為2和3，與各自子代的帶型一致，進(jìn)一步證明了此方法鑒別種質(zhì)的準(zhǔn)確性。同時，在育種過程中也可以通過分子身份證來推斷某些來源不明確的品系可能的親本。

構(gòu)建分子身份證要求引物具有一定的等位基因數(shù)，但并不是簡單的將等位基因數(shù)最多的引物篩選出來，而是要兼顧多樣性指數(shù)，將缺失過多和相似系數(shù)過高的引物剔除，用盡可能少的引物將全部材料區(qū)分開［16］。本研究中獲得的引物組合并非是能夠鑒別34份夏大豆種質(zhì)的唯一引物組合，選取的48 對引物中應(yīng)存在多個可將材料區(qū)分開的組合，本研究只是將其中最優(yōu)的一組篩選出來。

表2 含有特異帶型的材料及其對應(yīng)位點

表3 34份廣東夏大豆品種（系）的分子身份證

［1］王錦輝，王丹華，蔣洪蔚，等.利用野生大豆回交導(dǎo)入系定位油分含量QTL［J］.中國油料作物學(xué)報，2015（3）：277-284.

［2］趙團(tuán)結(jié)，蓋鈞鎰.栽培大豆起源與演化研究進(jìn)展［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，37（7）：954-962.

［3］邱麗娟，王昌陵，周國安，等.大豆分子育種研究進(jìn)展［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，40（11）：2418-2436.

［4］趙團(tuán)結(jié)，蓋鈞鎰，李海旺，等.超高產(chǎn)大豆育種研究的進(jìn)展與討論［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，39（1）：29-37.

［5］程本義，施勇峰，沈偉峰，等.水稻品種DNA指紋檢測技術(shù)體系及其應(yīng)用［J］.雜交水稻，2008，28 （1）：54-59.

［6］匡猛，楊偉華，許紅霞，等.中國棉花主栽品種DNA指紋圖譜構(gòu)建及SSR標(biāo)記遺傳多樣性分析［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44（1）：20-27.

［7］徐海風(fēng)，楊加銀，程保山.26份菜用大豆品種（系）指紋圖譜的構(gòu)建及其遺傳多樣性分析［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（5）：145-148.

［8］滕海濤，呂波，趙久然，等.利用DNA指紋圖譜輔助植物新品種保護(hù)的可能性［J］.生物技術(shù)通報，2009 （1）：1-6.

［9］陳昌文，曹珂，王力榮，等.中國桃主要品種資源及其野生近緣種的分子身份證構(gòu)建［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44（10）：2081-2093.

［10］高運來，朱榮勝，劉春燕，等.黑龍江部分大豆品種分子ID的構(gòu)建［J］.作物學(xué)報，2009，35（2）：211-218.

［11］李偉忠，許崇香，安英輝，等.257份玉米自交系分子ID的構(gòu)建［J］.玉米科學(xué)，2013（2）：24-30.

［12］王黎明，焦少杰，姜艷喜，等.142份甜高粱品種的分子身份證構(gòu)建［J］.作物學(xué)報，2011，37 （11）：1975-1983.

［13］馬琳，劉海珍，陸徐忠，等.130份甘藍(lán)型油菜種質(zhì)分子身份證的構(gòu)建［J］.中國油料作物學(xué)報，2013 （3）：231-239.

［14］劉新龍，馬麗，陳學(xué)寬，等.云南甘蔗自育品種DNA指紋身份證構(gòu)建［J］.作物學(xué)報，2010，36（2）：202-210.

［15］曾巧英.南方野生大豆耐鋁性關(guān)聯(lián)分析及對鋁響應(yīng)的miRNA［D］.廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

［16］杜晶晶.基于SSR標(biāo)記的葡萄遺傳多樣性分析及分子身份證構(gòu)建［D］.?？冢汉Ｄ洗髮W(xué)，2013： 59.

（責(zé)任編輯 楊賢智）

Establishment of molecular ID of summer soybean varieties （lines） in Guangdong

TANG Yu-juan1，2，SONG En-liang1，2，WANG Zi-yu1，3，MA Qi-bin1，NIAN Hai1
（1.College of Agriculture，South China Agricultural University/Guangdong Subcenter of National Center for Soybean Improvement，Guangzhou 510642，China；2.Guangxi Subtropical Crops Research Institute，Nanning 530001，China；3.Soybean Research Institute，Jilin Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130033，China）

To establish a fast and simple method for identifying Guangdong summer soybean varieties （lines），48 primers showing polymorphic bands were screened from 159 SSR primers covering 20 linkage groups of soybean chromosome，and be used to detected 34 Guangdong summer soybean varieties （lines）.The data number ranked from fragment size of allele variation were analyzed by the software ID Analysis 1.0 .The average number of alleles by each primer was 3.88，and the average of gene diversity index and polymorphism information content （PIC） of the 48 SSR loci was 0.50 and 0.45，respectively.These primers could be used to identify the Guangdong summer soybean germplasm.Only using five primers （Sat_267，Sat_235，Satt277，Sat_351 and Sat_292） could identify all 34 materials.A set of molecular ID was established for Guangdong summer soybean varieties （lines）.

summer soybean；molecular ID；SSR

S565.1

A

1004-874X（2016）05-0037-05

10.16768/j.issn.1004-874X.2016.05.008

2016-01-08