青龍白虎利咽含片的提取工藝研究

閆莉，傅超美，季寧平，廖婉，羅妮妮

青龍白虎湯出自清代著名醫(yī)家王孟英《王氏醫(yī)案》卷二，方由青果、生萊菔組成。青果素有清肺利咽、生津止渴之功；萊菔具有清熱生津、涼血止血之功，兩者合用，有清熱解毒、宣肺利咽之功，此湯劑在現(xiàn)代中醫(yī)藥臨床治療中亦得到廣泛應(yīng)用。為使傳統(tǒng)湯劑方便使用并進一步保證藥效，將其改變劑型制成含片。

方中君藥青果又名橄欖，《中國藥典》歷版均有收載[1]，既為可食鮮果，又為常用的傳統(tǒng)利咽中藥[2]，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)青果中含有較多的沒食子酸和黃酮類化合物[3～4]。萊菔又名蘿卜，在我國有1400多年用藥歷史，天然硫苷是其主要的特征性化學(xué)成分, 此外還含有脂肪酸、色素和一些酚酸類成分[5]。本試驗根據(jù)藥物的性質(zhì)，采用正交試驗設(shè)計優(yōu)選提取工藝，采用高效液相色譜法及紫外可見分光光度法分別測定提取工藝中指標(biāo)性成分沒食子酸和總黃酮的含量，以沒食子酸含量、總黃酮含量、干膏收率為考察對象進行綜合評分，確定青龍白虎利咽含片最佳提取工藝條件，從而為青龍白虎利咽含片的成型工藝研究提供試驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent1200高效液相色譜儀（Agilent1200二極管陣列檢測器，Agilent1200色譜工作站） （美國安捷倫科技有限公司）；Diamonsil TM C18色譜柱（250×4.6mm，5 μm，美國迪馬公司）； Mettler AE240 十萬分之一電子分析天平（德國Mettler公司）；FA1104萬分之一電子分析天平（上海天平儀器廠）；756PC紫外可見分光光度計（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-4(國華電器有限公司) ；粉碎機（DJ靈巧型，上海淀久中藥機械制造有限公司）；DGG-9240電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司）。

1.2 材料

青果飲片（購于四川瀘州百草堂中藥飲片有限公司，批號：120611-1），經(jīng)鑒定為橄欖科植物橄欖Canarium album Raeusch.的干燥成熟果實；市購新鮮白蘿卜；沒食子酸對照品（購于中國藥品生物制品檢定所，批號：0831-201201，供含量測定用)；蘆丁對照品（購于中國藥品生物制品檢定所，批號：0080-201205，供含量測定用)；甲醇為色譜純（美國Fisher公司），水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交試驗設(shè)計

根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，對影響該工藝的主要因素：加水量、煎煮時間、煎煮次數(shù), 用L9(34)正交試驗表進行優(yōu)選。以沒食子酸含量、總黃酮含量、干膏收率為考察指標(biāo)；各指標(biāo)的權(quán)重評分為，干膏收率占30分，沒食子酸含量占35分，總黃酮含量占35分，總分為100分。因素與水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 The design of L9(34) orthogonal test

2.2 干膏收率的測定

取青果細粉10 g，蘿卜鮮品打成漿10 g，共20 g，平行取9 份，依次按照正交試驗表中確定的試驗條件操作，將所得藥液濾過，濾液定容至250mL量瓶中，精密吸取25mL濾液于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴揮干，殘渣于105 ℃烘箱干燥3 h，取出，移至干燥器中，冷卻30分鐘，迅速稱重，計算干膏收率。

2.3 沒食子酸含量測定

2.3.1 色譜條件 Diamonsil TM C18色譜柱（250×4.6mm，5 μm）；流動相:甲醇-0.5%冰乙酸（7:93），檢測波長271 nm，柱溫30 ℃。理論塔板數(shù)按沒食子酸峰計應(yīng)不低于2000。見圖1。

圖1 陰性對照（A）、沒食子酸對照品（B）、樣品（C）的HPLC色譜圖Fig 1 HPLC Chromatogram of Blank solvent（A）Gallic acid control（B）and Sample（C）

2.3.2 對照品與供試品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對照品適量，置10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成0.2680mg﹒mL-1的對照品溶液。

取青果細粉10 g，蘿卜鮮品打成漿10 g，共20 g，平行取9 份，依次按照正交試驗表中確定的試驗條件操作，將所得藥液濾過，濾液定容至250mL量瓶中，將濾液用微孔濾膜過濾即得供試品溶液。

2.3.3 陰性對照溶液的制備 以缺青果藥材的處方為陰性對照，并按2.3.2項下供試品溶液的制備制得陰性對照溶液。

2.3.4 線性考察 分別精密吸取沒食子酸對照品溶液2，4，6，8，10μL注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下測定，記錄色譜圖，測定峰面積，以峰面積平均值（y）對進樣量（x）進行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得到回歸方程為y =3024x + 54.039，r=0.9999，沒食子酸在0.5360～2.680mg﹒mL-1范圍呈良好的線性關(guān)系。

2.3.5 精密度試驗 精密吸取沒食子酸對照品溶液，連續(xù)進樣6次，RSD值為0.82%，表明試驗所用儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品溶液分別于0，2，4，6，8，12，18 h進樣10μL，測定峰面積，RSD值為0.56%。結(jié)果表明樣品在18 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗 精密稱取各味藥各10 g，共5份，分別用水煎煮，提取液用微孔濾膜濾過即得供試品溶液，依法測得沒食子酸的平均含量為1.61mg﹒mL-1，RSD值為0.89%。

2.3.8 加樣回收率試驗 精密量取已知含量的樣品溶液1mL（0.1291mg﹒mL-1），共6份，分別精密加入沒食子酸對照品溶液1mL，按供試品制備方法及色譜條件，測定含量，計算平均加樣回收率為99.73%，RSD值為1.89%，表明本品回收率符合要求。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果(n=3)

2.3.9 樣品測定 取供試品溶液各10μL, 注入液相色譜儀, 測定, 即得。

2.4 總黃酮含量測定

2.4.1 對照品與供試品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品適量，置10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成0.0238mg﹒mL-1的對照品溶液。

取青果細粉10 g，蘿卜鮮品打成漿10 g，共20 g，平行取9 份，依次按照正交試驗表中確定的試驗條件操作，將所得藥液濾過，濾液定容至250mL量瓶中，將濾液離心后即得供試品溶液。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別移取上述配制好的蘆丁對照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5mL于10mL量瓶中，加水至5mL，依次加入5%亞硝酸鈉試液0.4mL，放置5min，10%硝酸鋁試液0.4mL，放置5min，4%氫氧化鈉試液4mL ，加水至刻度，混勻，放置15min 后，以相應(yīng)試劑做空白，于507 nm處測定吸光度，以對照品質(zhì)量濃度(C)與吸光度(A)進行直線回歸，得回歸方程: Y = 101.18X +0.0168 ( r = 0.9995)，在0.00119～0.00595mg﹒mL-1內(nèi)呈良好的線性。

2.4.3 精密度試驗 精密吸取蘆丁對照品溶液，按“2.4.2項”方法顯色后，連續(xù)進樣6次，RSD值為1.02%，表明試驗所用儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，按2.4.2項方法顯色后，分別在0，15，30，45，60min 測定A 值。結(jié)果表明供試品溶液顯色后在1 h 內(nèi)穩(wěn)定，RSD = 0.68%。

2.4.5 重復(fù)性試驗 精密稱取各味藥各10 g，共5份，分別加水煎煮，提取液濾過即得供試品溶液，按“2.4.2項”方法顯色后，測得總黃酮的平均含量為0.3712mg﹒mL-1，RSD值為0.99%。

2.4.6 加樣回收率試驗 精密量取已知總黃酮量的樣品液6 份（0.0300mg﹒mL-1）1mL，各分別加入蘆丁對照品溶液( 0.0238mg﹒mL-1) 1mL，按“2.4.2項”方法顯色，在507 nm 處測定吸光度，計算回收率，平均回收率為100.00%，RSD值為0.99%。見表3。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果(n=3)

2.4.7 樣品含量測定 取供試品溶液1mL，按“2.4.2項”方法顯色，以供試品溶液為空白，在507 nm 波長處測定A 值，計算含量。

2.5 試驗結(jié)果

依次測定每組沒食子酸及總黃酮含量、干膏得率, 試驗結(jié)果和結(jié)果分析見表4、表5。

表4 正交試驗結(jié)果

結(jié)果表明：根據(jù)綜合評分結(jié)果，由直觀分析可得影響提取效果的因素大小為：煎煮次數(shù)(C)>煎煮時間(B) >加水量(A)；對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析結(jié)果表明，煎煮次數(shù)對沒食子酸、總黃酮量及干膏收率有顯著性影響，煎煮時間和加水量對沒食子酸、總黃酮得量及干膏收率無顯著性影響。綜合直觀分析和方差分析結(jié)果，結(jié)合工業(yè)化大生產(chǎn)節(jié)約能效、降低生產(chǎn)成本考慮，確定最佳提取工藝為A1B1C2，即加8倍量水，煎煮2次，每次1小時。

2.6 驗證試驗

按正交試驗篩選出的最佳提取工藝，重復(fù)試驗三次，結(jié)果沒食子酸平均含量為1.922mg﹒g-1，總黃酮平均含量為0.4891mg﹒g-1，干膏收率為19.21%。三者的RSD值依次為0.11%，0.19%，0.15%，表明所確定的最佳工藝穩(wěn)定，合理可行。

3 討論

3.1 指標(biāo)性成分的選擇

在確定提取工藝的評價指標(biāo)時，因方中主藥青果在《中國藥典》2010版中無含量測定指標(biāo)要求，而沒食子酸作為青果中最主要且含量較多的有效成分，對多種致病菌有抑制作用，同時有抗炎、抗腫瘤、保肝之效，所以作為指標(biāo)性成分之一，考慮到此成分的專屬性不強且主要由鞣質(zhì)水解而來，定量分析會產(chǎn)生波動，本試驗還選用青果中具有抑菌抗炎藥理活性的總黃酮成分作為指標(biāo)。

3.2 提取溶劑的選擇及青果不同粉末粒度的考察

考慮處方中藥物所含主要有效成分的極性較大，因此預(yù)實驗比較了水及30%乙醇的提取效果。水提所得的沒食子酸含量和干膏收率均大于醇提，故采用水煎煮的方法。

將青果飲片碎成四種粒度最粗粉、粗粉、中粉、細粉進行考察，同樣以沒食子酸含量、總黃酮含量、干膏收率為評價指標(biāo)進行綜合評分，結(jié)果細粉得分最高，故選用細粉進行提取。

3.3 流動相的選擇

測定沒食子酸成分時，試驗分別比較了《中國藥典》2010年版五倍子含量測定項下沒食子酸測定所選用的甲醇-0.1%磷酸水和文獻中[6]測定青果中沒食子酸采用的甲醇-0.5%冰乙酸作為流動相，結(jié)果甲醇-0.5%冰乙酸的效果較好，故選為流動相。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:183.

[2]廖婉,游宇,張臻,等.中藥青果在現(xiàn)代美容領(lǐng)域的研究進展[J].中藥與臨床,2012,3(2):60.

[3]王恒,宋良科,湯昊.不同種質(zhì)青果清熱利咽化學(xué)組分的研究[J].中國中藥雜志,2010, 35 (6):669.

[4]何志勇,夏文水.中藥青果化學(xué)成分及藥理研究進展[J].中成藥,2006,28(7):1024.

[5]段禮新,蔡光明,陳芳,等.萊菔的研究進展[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報,2007,3(23):204.

[6]張鈺泉,葉福媛,吳倩,張寧.高效液相色譜法測定青果中沒食子酸的含量[J].時珍國醫(yī)國藥,2002,13(7):388.