松醇油降解菌的分離鑒定及降解條件優(yōu)化

梁杰慧，孫水裕，杜青平，劉敬勇，黃紹松，尹光彩，田 靜，曾佳俊，許娉婷

(廣東工業(yè)大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510006)

松醇油是國內(nèi)外鉛鋅硫化礦選礦中使用最廣泛的起泡劑，它是在以松節(jié)油為原料、硫酸為催化劑，酒精或平平加(一種表面活性劑)為乳化劑的參與下，發(fā)生水解反應(yīng)制取的。其主要化學(xué)成分萜烯醇是一種環(huán)狀結(jié)構(gòu)，難以自然降解，會殘留在選礦廢水中[1-3]，從而導(dǎo)致選礦廢水的化學(xué)需氧量(COD)升高，使選礦廢水難以達(dá)標(biāo)排放并對水體中的動植物和人類構(gòu)成威脅[4-5]。

目前，國內(nèi)外處理選礦廢水的方法主要有酸堿中和法[6]、混凝沉降法[7]、化學(xué)氧化法[8]、人工濕地法[9]和微生物法[10]。酸堿中和法和混凝沉降法存在結(jié)垢嚴(yán)重、沉淀污泥量大、易造成二次污染等弊端，且不易去除殘留在選礦廢水中的有機浮選藥劑(如黃藥和松醇油)，化學(xué)氧化法處理費用高；人工濕地法占地面積大，易受外界環(huán)境的影響；微生物降解法具有高效降解有機污染物、無二次污染、費用低等優(yōu)點，已經(jīng)引起越來越多研究者的關(guān)注[5]。LI等[11]用兩段接觸氧化生物吸附反應(yīng)器處理銅礦選礦廢水，經(jīng)過長期運營發(fā)現(xiàn)該反應(yīng)器能有效去除重金屬，化學(xué)需氧量和氨氮的去除率分別達(dá)到 84.1%和 71.3%。HE等[12]采用厭氧/生物活性碳反應(yīng)器對模擬選礦廢水進(jìn)行處理，在最佳碳水比(質(zhì)量比)為2:1、最佳氣水比(質(zhì)量比)為3:1、水力停留時間為4 h時，可將模擬廢水COD濃度由300 mg/L降至 100 mg/L以下。LI[13]研究了葡萄球菌Auricularis對礦山廢水中重金屬的生物吸附能力，發(fā)現(xiàn)當(dāng)菌劑量為15 g/L時，100 mg/L Cu和50 mg/L Zn的去除率分別是 77.1%和 56.3%。張萍等[14]及肖華花[15]從南京某硫化礦溢流井廢水中分別篩選出能高效降解捕收劑黃藥和黑藥的降解菌，初步鑒定為假單胞菌屬，并研究了其降解特性。但目前國內(nèi)外對選礦廢水生物處理的研究主要針對重金屬離子、黃藥、黑藥等目標(biāo)污染物的去除或降解，對于微生物法降解選礦廢水中常見起泡劑松醇油的研究還未見報道。本文作者對亞洲最大的硫化鉛鋅礦——廣東省韶關(guān)市凡口鉛鋅礦尾礦庫周邊的土樣進(jìn)行取樣、富集、培養(yǎng)，并分離出一株以松醇油為唯一碳源的高效降解菌，研究其對松醇油的降解特性及最佳條件，從而為微生物凈化處理含殘留松醇油的尾礦庫廢水提供試驗依據(jù)。

1 實驗

1.1 培養(yǎng)基

無機鹽培養(yǎng)基按照文獻(xiàn)[15]配制；以松醇油為唯一碳源的富集培養(yǎng)基：將無機鹽培養(yǎng)基滅菌，冷卻后加入松醇油；固體選擇培養(yǎng)基：在富集培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入20 g/L瓊脂粉；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基用于制備種子液和菌種斜面保存。

1.2 松醇油降解菌的富集分離

實驗土樣采自凡口鉛鋅礦尾礦庫周邊的土壤。細(xì)菌富集分離過程采用定時定量、逐步提高松醇油濃度的方法。將實驗土樣于37 ℃生化培養(yǎng)箱活化3 d，稱取5.0 g土樣于盛有100 mL已滅菌的富集培養(yǎng)基(加入1%松醇油)的錐形瓶中，在37 ℃、120 r/min水浴搖床中培養(yǎng)7 d后，以10%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接入新鮮的富集培養(yǎng)基(加入2%松醇油)，同樣條件下培養(yǎng)7 d。繼續(xù)提高碳源濃度，以同樣的接種量接入新鮮的富集培養(yǎng)基(加入3%松醇油)，相同條件下馴化7 d。取最后富集液用稀釋平板法進(jìn)行分離，選取單菌落接種到以松醇油為唯一碳源的固體選擇培養(yǎng)基上，反復(fù)多次，最終得到分離和純化，選取生長良好的單菌落保存。

1.3 分離菌株的鑒定

對分離篩選得到的松醇油降解菌 KS-1，參照文獻(xiàn)[16-17]，采用菌落形態(tài)觀察、生理生化特征實驗及16SrDNA序列分析相結(jié)合的方法進(jìn)行鑒定。將16SrDNA測序結(jié)果運用BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比較，從中獲得與菌株 KS-1序列最相近的 16SrDNA 序列(即參照序列)，然后使用CLUSTAL X 1.81軟件對菌株KS-1的序列和參照序列進(jìn)行對比，利用MEGA 3.1軟件，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 菌懸液的制備

在無菌條件下，選取單菌落接種到已滅菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，在37 ℃、120 r/min搖床中培養(yǎng)16 h，并將菌液在12 000 r/min條件下離心15 min，去掉上清液，用已滅菌的無機鹽培養(yǎng)基重懸，使細(xì)菌的數(shù)目達(dá)到108 mL-1。

1.5 松醇油降解試驗

松醇油由廣東省韶關(guān)市凡口鉛鋅礦選廠提供。無菌條件下，按照15%的接種量將菌懸液接種到已滅菌的無機鹽培養(yǎng)基中，并加入松醇油使得松醇油的濃度為300 mg/L，在37 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)7 d。為研究松醇油降解菌對選礦廢水中COD的降解能力，在本研究中采用 COD來衡量目標(biāo)菌株對松醇油的降解效果。每天定時取上述培養(yǎng)液在12 000 r/min條件下離心15 min，取上清液測定COD；同時取樣直接測定細(xì)菌生長量。COD按照文獻(xiàn)[18]測定。菌株生物量采用比濁法[19]于600 nm處測定其吸光度，即OD600值。

1.6 正交試驗設(shè)計

運用正交試驗法研究松醇油降解菌的降解特性。根據(jù)文獻(xiàn)[20]確定本實驗的影響因素為4個，4因素3水平可采用 L9(34)正交表。選擇對降解菌生長影響較大的pH值、接種量、搖床轉(zhuǎn)速和松醇油濃度4個因素作為考察對象。松醇油降解菌的降解條件的因素與水平見表1。

表1 松醇油降解菌降解條件的正交因素與水平Table 1 Orthogonal factors and levels of degradation conditions by pine oil degrading bacteria

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的分離及鑒定

2.1.1 形態(tài)及生理生化特征

以松醇油為唯一碳源富集分離，逐步馴化，篩選出一株能在固體選擇培養(yǎng)基中生長迅速、外形較大的菌株作為試驗菌株，命名為KS-1。菌株KS-1在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，菌落表面粗糙不透明，呈白色或微黃色。菌株 SEM 像顯示，該菌株為桿狀，菌體大小為(1.0±0.05)μm×(1.8±0.2)μm，如圖1所示。菌株革蘭氏染色結(jié)果為陽性，呈芽孢橢圓狀或柱狀，位于菌體中央或稍偏，有鞭毛，能運動。

圖1 菌株KS-1的SEM像Fig.1 SEM image of KS-1

根據(jù)文獻(xiàn)[16-17]有針對性地進(jìn)行生理生化試驗，結(jié)果見表2。表2表明，菌株 KS-1好氧，接觸酶試驗、硝酸鹽還原試驗和V-P測定呈陽性反應(yīng)，能利用葡萄糖、木糖、甘露醇、檸檬酸鹽，能水解淀粉和明膠，不能利用吲哚、卵黃卵磷脂酶、苯丙氨酸脫氨酶和丙酸鹽。以上鑒定結(jié)果與微生物分類法[16-17]和王海峰等[21]報道的枯草芽孢桿菌的生理生化特征一致。初步確定菌株KS-1為枯草芽孢桿菌。

表2 菌株KS-1的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characters of KS-1

2.1.2 16SrDNA序列分析

將菌株提取基因組DNA后進(jìn)行16S rDNA片段的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測，并進(jìn)行測序，序列長度為 1 458 bp，在 GenBank中登錄號為GU272021。將菌株KS-1的16S rDNA的基因序列運用BLAST軟件和GenBank中的序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明，菌株KS-1與Bacillus subtilisAF0907序列同源性達(dá)100%。結(jié)合菌株KS-1株的菌株形態(tài)特征和生理生化特征，鑒定菌株 KS-1為枯草芽孢桿菌AF0907(Bacillus subtilisAF0907)。菌株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹見圖2。

2.2 化學(xué)需氧量(COD)變化特性

將菌株活化并制備菌懸液后接種到松醇油降解培養(yǎng)基中，測定 COD去除率和 OD600值，結(jié)果如圖3所示。

圖2 菌株KS-1的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of KS-1

圖3 菌株KS-1對松醇油的降解結(jié)果Fig.3 Degrading results of pine oil by KS-1

從圖3可以看出，COD的去除率與菌株KS-1生長量的變化趨勢基本吻合。接種后的第 1～3天菌株KS-1處于延滯期，細(xì)菌生長量少，COD的去除率不高，對松醇油的降解速度較慢。這是因為當(dāng)菌株從營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到一個營養(yǎng)不良培養(yǎng)基時，會出現(xiàn)延滯期；在特定培養(yǎng)基中，細(xì)胞生長必須具備一套完整的酶系去合成培養(yǎng)基中不存在但對細(xì)胞來說又是必需的代謝物。當(dāng)微生物轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基時，需要時間去合成新的酶[22]。從第3天開始菌株生長量持續(xù)快速增加，菌株處于對數(shù)生長期，此時細(xì)菌數(shù)量多且活性高，COD的去除率不斷升高，對松醇油的降解明顯加快，表明此階段菌株充分利用自身合成的酶，以松醇油為碳源，大量繁殖。到第6天COD的降解率達(dá)到51.9%，第7天菌株生長量和COD去除率都開始下降，這是由于培養(yǎng)基中碳源松醇油的消耗，中間代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，細(xì)胞毒素的積累，細(xì)菌繁殖速度下降。

目前，關(guān)于松醇油的吸附去除與臭氧氧化法去除已有研究。張曉茜[23]研究了不同濾料(鎂渣濾料、鋁渣、石英砂)對松醇油的吸附作用，發(fā)現(xiàn)在相同的松醇油濃度下，鎂渣濾料吸附容量最大，但松醇油去除率只有12.904%。歐陽魁[24]用臭氧法去除松醇油，當(dāng)臭氧氧化6 min時，松醇油去除率達(dá)到95.26%，但臭氧不穩(wěn)定、易分解、不能貯存，必須在使用現(xiàn)場制造，且臭氧發(fā)生器能耗高、設(shè)備操作及維修麻煩，水質(zhì)水量變化時，投加量調(diào)節(jié)困難，因此，臭氧氧化法應(yīng)用于大量尾礦庫廢水的治理成本過高，工程應(yīng)用可能性小。與以上方法相比，在本研究中篩選得到的菌株KS-1對松醇油的降解效率高、成本低、無二次污染，且枯草芽孢桿菌對不同營養(yǎng)化水體的凈水作用已有報道[25]，表明菌株 KS-1在降解廢水中松醇油具有良好的應(yīng)用前景。

2.3 松醇油降解菌降解條件優(yōu)化

根據(jù)文獻(xiàn)[20]，運用綜合平衡法對試驗結(jié)果進(jìn)行極差分析，結(jié)果見表3。計算步驟如下：逐列計算各因素同一水平之和，記作X1、X2和X3；逐列計算各水平的平均數(shù)記作、和；逐列計算各水平平均數(shù)的極差，記作R。計算公式如下：

2.3.1 主次順序的確定和初選優(yōu)化降解條件

根據(jù)表3可知，對于試驗指標(biāo)OD600，4個因素極差由大到小的順序為RA、RC、RB、RD。由此可知，各因素對菌株 KS-1的生長情況影響由大到小的順序為A、C、B、D；根據(jù)各因素水平的值，確定各因素的優(yōu)化水平組合為A1B3C3D2。對于試驗指標(biāo)COD降解率，4個因素的極差由大到小的順序為RD、RC、RB、RA。由此可知，各因素對 COD降解率影響由大到小的順序為D、C、B、A；根據(jù)各因素水平的值，確定各因素的優(yōu)化水平組合為A2B3C3D3。

2.3.2 綜合平衡法確定最優(yōu)降解條件

由于兩個指標(biāo)單獨分析得到的優(yōu)化條件不一致，必須對因素的影響主次順序進(jìn)行綜合考慮，確定最佳降解條件。

表3 松醇油降解菌降解條件正交試驗的極差分析Table 3 Orthogonal test intuitive analysis chart of degradation conditions for pine oil degrading bacteria

對于因素A，其對OD600值影響最大，排第1位，取A1為好；但其對COD降解率的影響排第4位，為次要的。因此，應(yīng)以O(shè)D600值這一指標(biāo)考慮，選取A因素為A1。對于因素B，其對OD600值和COD降解率影響都排第3位，且均取B3為好，故B因素選取B3。對于因素C，其對OD600值和COD降解率影響都排第2位，且均取C3為好，故C因素選取C3。對于因素D，其對COD降解率影響排第一位，取D3為好；其對OD600值的影響排第4位，為次要的。因此，應(yīng)以COD降解率這一指標(biāo)考慮，選取D為D3。

本實驗的優(yōu)化組合為A1B3C3D3，即pH值為4，接種量為15%，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，松醇油濃度為300 mg/L。此優(yōu)化組合即是試驗3，試驗指標(biāo)COD從653.27 mg/L下降到222.70 mg/L，去除率達(dá)到65.91%，OD600為0.239，均為最大值。結(jié)果表明，菌株在酸性條件下生長良好，能夠降解高濃度松醇油，且在松醇油濃度較高的情況下，適當(dāng)增大接種量和提高搖床轉(zhuǎn)速可以提高菌株KS-1對松醇油的降解率。

3 結(jié)論

1)從廣東省韶關(guān)市凡口鉛鋅礦尾礦庫周邊土壤中篩選出一株能高效降解松醇油的細(xì)菌KS-1，經(jīng)對其進(jìn)行形態(tài)特征、生理生化特征鑒定及 16SrDNA序列分析，鑒定菌株KS-1為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis AF0907)。

2)松醇油降解菌降低含松醇油廢水COD的優(yōu)化條件如下：pH 4、接種量15%、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min、松醇油濃度300 mg/L，在此條件下，COD從653.27 mg/L降到222.70 mg/L，去除率達(dá)到65.91%。

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