耐高溫乳酸菌的篩選

賴 穎,王雙雙

(周口師范學(xué)院生命科學(xué)系,河南周口466001)

乳酸菌能夠提高食品的營養(yǎng)價值,可以延長食品的保存時限,改善人體的代謝環(huán)境,提高人體免疫力,具有抗腫瘤和抗突變的特性,對人體腸道內(nèi)腐敗菌的生長繁殖有抑制作用[1]。由此可見,乳酸菌的生理功能與機(jī)體的生命活動息息相關(guān)[2]。乳酸菌被廣泛應(yīng)用于輕工業(yè)、食品、醫(yī)藥及飼料工業(yè)等許多行業(yè)[3]。在眾多固態(tài)發(fā)酵領(lǐng)域中一個難以解決的問題是固態(tài)發(fā)酵中迅速產(chǎn)生的高溫對乳酸菌有殺滅作用,因而選育耐高溫菌株具有極為重要的理論意義和廣闊的應(yīng)用前景[4]。通常乳酸菌的發(fā)酵溫度為37℃,一旦溫度提高后,乳酸菌的發(fā)酵能力就會有所下降?？墒窃诠I(yè)生產(chǎn)過程中,提高發(fā)酵溫度可以降低工廠生產(chǎn)中的能耗,還可以減少發(fā)酵過程中染菌的可能性,減少倒灌概率,簡化后期提純的工序。因此如何改良乳酸菌的高溫耐受性,已經(jīng)引起了國內(nèi)外研究者的關(guān)注。本文對從泡菜汁中分離的乳酸菌進(jìn)行溫度梯度培養(yǎng),并選育出對溫度耐受性較好的乳酸菌。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品

新鮮的泡菜汁

1.1.2 主要試劑

(1)焦性沒食子酸溶液:焦性沒食子酸和Na2CO3分別稱取3 g,溶于蒸餾水中,定容到10 m L。

(2)接觸酶試劑:量取過氧化氫溶液0.3 m L與9.7 m L的蒸餾水混合。

(3)革蘭氏試劑,吲哚試劑,明膠,磺胺酸冰醋酸溶液,α-萘胺乙醇溶液,碳酸鈣,生理鹽水,香柏油。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基[5]:蛋白胨5 g,牛肉膏5 g,酵母膏2.5 g,檸檬酸氫二銨1 g,葡萄糖10 g,吐溫80 0.5 m L,乙酸鈉2.5 g,磷酸氫二鉀1 g,硫酸鎂0.29 g,硫酸錳0.125 g,瓊脂9 g,蒸餾水500 m L, p H=6.2～6.6,然后于0.1 MPa、121℃下滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基:液體MRS培養(yǎng)基。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母粉15.0 g,葡萄糖100.0 g,蒸餾水1 000 m L,于0.1 MPa、121℃下滅菌30 min。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備

全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、光學(xué)顯微鏡、恒溫振蕩器。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的初篩

新鮮的泡菜汁1 m L移入盛有9 m L的滅菌生理鹽水的試管中,搖勻。然后將上述樣品稀釋至10-5,10-6,10-7,分別吸取10-5,10-6,10-7稀釋液0.1 m L加到含0.5%CaCO3的MRS培養(yǎng)基上,37℃厭氧培養(yǎng)24 h～48 h,形成菌落后觀察其形態(tài),挑取周圍有溶鈣圈的菌落,在MRS平板上反復(fù)劃線直到得到單菌落。

1.2.2 乳酸菌的鑒定

(1)菌落的形態(tài)鑒定。菌落觀察,革蘭氏染色,芽孢染色,鞭毛染色。

(2)乳酸菌生理生化鑒定。吲哚試驗(yàn),過氧化氫酶試驗(yàn),還原硝酸鹽試驗(yàn),明膠液化試驗(yàn)

1.2.3 乳酸菌的復(fù)篩

將待測菌株活化后分別置于溫度為50℃、55℃、60℃、65℃的恒溫箱中,培養(yǎng)48 h后,測其總菌數(shù)。選擇直徑大、密集、生長情況良好的菌株作為后續(xù)研究的對象。

1.2.4 乳酸菌生長曲線的測定

挑取得到的良好耐高溫乳酸菌菌株3環(huán)接種到30 m L液體MRS培養(yǎng)基上,以MRS液體培養(yǎng)基為空白對照,每隔2 h測其OD600值。以時間為橫坐標(biāo),OD600值為縱坐標(biāo)作圖,得到乳酸菌的生長曲線。

1.2.5 乳酸菌發(fā)酵條件的研究

(1)乳酸菌產(chǎn)酸研究:接種量、裝液量、轉(zhuǎn)速、溫度是決定乳酸菌產(chǎn)酸的關(guān)鍵,采用正交設(shè)計試驗(yàn)對乳酸菌的最佳產(chǎn)酸條件進(jìn)行研究,其因子、水平見表1。

表1 正交設(shè)計試驗(yàn)的因子和水平

(2)乳酸菌在最適發(fā)酵條件下的發(fā)酵情況:根據(jù)上述正交試驗(yàn)得出的最適發(fā)酵條件對乳酸菌進(jìn)行培養(yǎng),每3 h測定乳酸的產(chǎn)量并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的初篩

從樣品中分離到溶鈣圈較大的菌株共兩株,顯微鏡下觀察菌體形態(tài),兩株都為桿菌,一株為Y5,一株為Y9。

2.2 乳酸菌的鑒定

表2 乳酸菌的形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定結(jié)果

由表2、圖1、圖2可以得出如下結(jié)果。菌株Y5、Y9的革蘭氏染色均呈陽性,Y5菌落形態(tài)呈灰白色、圓形、邊緣完整、表面光滑、隆起,Y9菌落顏鹽還原、H2S試驗(yàn)、明膠水解、吲哚反應(yīng)及接觸酶試驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。根據(jù)以上鑒定結(jié)果,參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》及《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》,菌株Y5、Y9屬于乳桿菌。

2.3 乳酸菌的復(fù)篩

由表3得出菌株Y5的菌體濃度大于菌株Y9,所以選擇菌株Y5作下一步的試驗(yàn)。

表3 不同溫度下菌株的菌數(shù)情況(X 108個/mL)

2.4 乳酸菌的生長曲線

繪制生長曲線見圖3。由圖3可以看出,接種后的前6 h為延滯期,6 h以后菌體生長進(jìn)入對數(shù)生長期,18 h到32 h菌體生長較為穩(wěn)定,32 h后菌體生長量快速下降,菌體生長進(jìn)入衰亡期。由于菌株在對數(shù)生長期細(xì)胞分裂速度最快、代謝活動旺盛、生長速率最快,所以接種時通常選用對數(shù)生長期的菌株,以減少延滯期的時間,降低發(fā)酵成本。通過乳酸菌的生長曲線可以選取培養(yǎng)14 h的乳酸菌接種。

圖3 乳酸菌的生長曲線

2.5 乳酸菌的發(fā)酵條件

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知,通過極差分析,在乳酸菌的發(fā)酵過程中,影響乳酸菌發(fā)酵的因子按從大到小的順序依次為B>A>D>C,即裝液量為顯著性影響因素。通過正交分析得出最佳發(fā)酵條件為A3B1C3D2,即以發(fā)酵為目的的最適發(fā)酵條件為:接種量為7%,裝液量為100 m L,轉(zhuǎn)速為60 r/min,溫度為55℃。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)對泡菜汁中的微生物進(jìn)行分離純化,并通過分析乳酸菌發(fā)酵過程中微生物菌體濃度的變化與生長情況,初步確定所篩菌株Y5的最高適合發(fā)酵溫度為55℃,發(fā)酵時間為36 h。

進(jìn)一步研究菌株Y5的產(chǎn)酸培養(yǎng)條件,從接種量、裝液量、轉(zhuǎn)速、溫度幾個方面進(jìn)行正交試驗(yàn)的結(jié)果為:接種量是顯著性影響因素。乳酸菌Y5的最佳產(chǎn)酸條件為:接種量為7%,裝液量為100 m L,轉(zhuǎn)速為60 r/min,溫度為55℃。在最佳條件下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn),得出菌株Y5的最大產(chǎn)酸量為49.65 g/m L。

大多數(shù)乳酸菌的最適發(fā)酵溫度都是37℃,在發(fā)酵過程中如果提高溫度,其產(chǎn)量將大大降低。本試驗(yàn)篩選的乳酸菌能夠在55℃下發(fā)酵,產(chǎn)酸量也較高。為今后選育耐高溫型乳酸菌奠定了基礎(chǔ)。由于本試驗(yàn)在發(fā)酵過程中采取的發(fā)酵溫度較高,整個發(fā)酵過程中,有一定水分的流失,因此對后來測定的產(chǎn)酸量會有一定的影響,數(shù)值會有一些偏差,有待于進(jìn)一步改進(jìn)。

[1]閆波,劉寧.乳酸菌及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用與展望[J].食品開發(fā)與研究,2004,25(4):22-23.

[2]席北斗,劉鴻亮,白慶中,等.堆肥中纖維素和木質(zhì)素的生物降解研究現(xiàn)狀[J].環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備, 2002,3(3):19-23.

[3]吳祖興.乳酸菌在發(fā)酵香腸中的應(yīng)用研究[J].食品工業(yè)科技,2002,23(8):55-57.

[4]趙玉紅,張立鋼,龐偉娜.乳酸菌和酵母菌共生發(fā)酵面包的研究[J].食品工業(yè)科技,2003,24(3):61-62.

[5]喬發(fā)樂,吳秀芳,南慶賢,等.濃縮型乳酸菌發(fā)酵劑的現(xiàn)狀[J].中國乳品工業(yè),1998,26(11):22-23.