毛細胞自發(fā)活性對螺旋神經(jīng)節(jié)生存及其外周靶支配的影響

孔德秋 敖華飛

感音神經(jīng)性聾和耳鳴是兩種最為常見的聽覺系統(tǒng)疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織1996年估計，全世界聾殘患者約有1.2億人。我國每年新生先天性耳聾患兒3萬余人。而占全世界總人口15%以上的人群遭受經(jīng)常性或永久性主觀耳鳴的困擾［1］。而聽覺感受器毛細胞及其傳入纖維是兩個常見的病變部位。當Ⅰ型螺旋神經(jīng)節(jié)細胞內(nèi)毛細胞之間的突觸或其軸突出現(xiàn)故障，將出現(xiàn)聽覺神經(jīng)?。?，3］。當Ⅰ型髓鞘包裹的螺旋神經(jīng)節(jié)樹突和軸突因炎癥、腫瘤或血管壓迫脫髓鞘，誘導的局部脫髓鞘導致胞體或軸突局部合成的離子通道及各種受體等蛋白異常堆積在軸突損傷區(qū)神經(jīng)元的胞體膜上，引起受損的初級傳入神經(jīng)元異位興奮和反應性自發(fā)增加，成為異位電活動的起博點［4～6］。這是耳鳴外周起源的機制之一。臨床上更為常見的是繼Ⅱ型神經(jīng)節(jié)外周傳入的損傷而出現(xiàn)的耳鳴和感音神經(jīng)性聾。當外毛細胞Ⅱ型傳入對內(nèi)毛細胞興奮輸入調節(jié)出現(xiàn)故障，將引起聽覺通路的超活性，可能出現(xiàn)耳鳴癥狀［7，8］。目前耳聾和耳鳴治療的目的都是盡可能恢復聽覺通路正常的音頻定位傳音結構和功能。在先天性和出生后聽力損失的病人，維持殘存神經(jīng)節(jié)生存和促進其外周軸突生長，能明顯改進我們現(xiàn)在進行的耳聾治療，如人工耳蝸置入的效果。當鳥類毛細胞再生后，或當神經(jīng)干細胞耳蝸置入后，毛細胞自發(fā)活性在螺旋神經(jīng)節(jié)細胞與外周靶建立正確突觸連接的過程中同樣起重要作用?；趦煞N類型的螺旋神經(jīng)節(jié)正確的外周靶音頻定位支配和軸突本身的完整性在正常聽覺產(chǎn)生和聽覺康復中重要作用，使明確螺旋神經(jīng)節(jié)發(fā)育，及其外周靶支配的建立和維持的機制變得尤為迫切。

一、毛細胞自發(fā)活性的產(chǎn)生與消失

耳蝸內(nèi)毛細胞能產(chǎn)生兩種電位，即自發(fā)動作電位和感受器電位。在聽力發(fā)生后，聲波通過鼓膜振動并經(jīng)聽骨鏈將機械振動傳遞到內(nèi)耳引起基膜振動，毛細胞頂部表皮板上的纖毛與蓋膜之間發(fā)生相對移動，產(chǎn)生的機械剪切力使毛細胞頂端的非特異性陽離子通道開放，Na+、K+、Ca2+等陽離子內(nèi)流，細胞內(nèi)電位向去極化變化，使毛細胞底側膜上的鈣離子通道開放，毛細胞電位繼續(xù)去極化，產(chǎn)生的這種電位稱感受器電位。與感受器電位不同，在胚胎晚期和出生后早期(E17～P12)，耳蝸毛細胞對聲音沒有反應，即在不接受外界聲刺激的情況下，產(chǎn)生鋒電位，從而引起聽神經(jīng)興奮，這種不受外界刺激就能產(chǎn)生的自發(fā)動作電位稱為毛細胞的自發(fā)活性。

研究表明，ATP與毛細胞自發(fā)活性的產(chǎn)生有密切聯(lián)系。Nicolas等［7］用 PPADS(pyridoxal-phosphate-6-azophenyl-2'，4'-disulphonate)和蘇拉明作為受體阻滯劑，證明胞外ATP可以使耳蝸內(nèi)產(chǎn)生自發(fā)動作電位。位于Corti器內(nèi)的支持細胞能通過表面縫隙連接和不成對的半通道連接蛋白周期性地自發(fā)釋放ATP，釋放到內(nèi)淋巴內(nèi)的ATP作用于內(nèi)毛細胞(IHCs)上的離子通道型受體P2X和G蛋白偶聯(lián)代謝型受體P2Y，P2X受體介導Ca2+流入胞內(nèi)，P2Y受體則介導胞內(nèi)鈣庫釋放，其中P2X受體介導的Ca2+內(nèi)流起主要作用。胞內(nèi)Ca2+增加使IHCs膜發(fā)生去極化，產(chǎn)生自發(fā)活性。ATP不僅直接參與Ca2+內(nèi)流，還可以調節(jié)胞內(nèi) Ca2+濃度水平。Harada等［8，9］研究發(fā)現(xiàn)胞外的ATP可以通過胞內(nèi)生成NO來調節(jié)Ca2+平衡，從而影響IHCs的膜電位。內(nèi)流的Ca2+激活一氧化氮(NO)合酶，合成的NO作用于可溶鳥苷酸環(huán)化酶(sGC)，通過NO-cGMP-PKG信號傳導途徑，反饋調節(jié)胞內(nèi)Ca2+水平，使胞內(nèi)Ca2+維持在一個合適的濃度范圍，保持膜的正常興奮性。

IHCs的去極化激活膜上L型CaV1.3通道開放，介導Ca2+大量內(nèi)流，使胞內(nèi)Ca2+濃度繼續(xù)增加(90%的Ca2+電流都是由CaV1.3通道介導［10］)，使位于帶狀突觸活性區(qū)域上的準備釋放池(RRP)的囊泡開始融合，釋放出谷氨酸，然后作用于突觸后膜上的離子型谷氨酸受體(NMDA和AMPA)和代謝型谷氨酸受體(mGluR1)，產(chǎn)生誘發(fā)的興奮性突觸后電流(eEPSCs)和微小興奮性突觸后電流(mEPSCs)，進而使初級聽覺傳入神經(jīng)興奮，螺旋神經(jīng)節(jié)細胞(SGNs)產(chǎn)生動作電位，繼而整個聽覺通路興奮，表現(xiàn)為聽覺系統(tǒng)的自發(fā)活性［11］。

不同物種毛細胞自發(fā)活性產(chǎn)生的時間不同。小鼠在胚胎期17.5天(E17.5)就能產(chǎn)生自發(fā)活性，其中耳蝸頂和耳蝸底分別在E18.5和E17.5表現(xiàn)出自發(fā)活性［12］。而大鼠在出生后數(shù)天內(nèi)(P3～P11)才出現(xiàn)自發(fā)電位。但哺乳動物在聽力發(fā)生后(約P12左右)自發(fā)活性都基本消失。自發(fā)活性的產(chǎn)生與消失是多種離子通道綜合作用的結果［13，14］。內(nèi)向整流鉀離子電流和延遲整流鉀離子電流能夠穩(wěn)定發(fā)育早期耳蝸內(nèi)毛細胞靜息電位，鈣離子電流是產(chǎn)生自發(fā)動作電位的主要因素。低電導、鈣敏感的SK2通道電流和延遲整流鉀離子電流介導電位復極化，使動作電位重復再生，表現(xiàn)出周期性。在聽力發(fā)生前后，IHCs的內(nèi)向整流鉀離子電流和高電導、鈣敏感BK通道電流使內(nèi)毛細胞膜電位超極化，加上支持細胞(ISCs)停止釋放ATP(可能與ISCs數(shù)量和ISCs表面半通道蛋白減少有關)，IHCs的去極化電位消失，谷氨酸釋放停止，IHCs自發(fā)活性消失［15］。

和IHCs相比，發(fā)育早期耳蝸外側3排的外毛細胞(OHCs)只能產(chǎn)生短暫的自發(fā)動作電位。IHCs作為聽覺系統(tǒng)的初級感覺細胞，受Ⅰ型SGNs(90%～95%SGNs)支配，能將外界的聲音的頻率和強度信息轉化成電信號傳遞到中樞系統(tǒng)，而具有電運動性的OHCs，受Ⅱ型SGNs(5%～10%SGNs)支配，使耳蝸對聲音的頻率具有高度敏感性和選擇性，對聲音有放大作用，為聽覺通路提供反饋信息，但在耳蝸發(fā)育早期(P0～P3)，OHCs受Ⅰ型SGNs短暫支配，在這期間，能產(chǎn)生自發(fā)動作電位并分泌谷氨酸，發(fā)生機制與IHCs相似，出生后3天OHCs自發(fā)鈣動作電位活性消失，可能與快速減少的L-型鈣離子通道和增加的內(nèi)向整流的鉀離子通道有關［16，17］。

二、毛細胞自發(fā)活性與兩型螺旋神經(jīng)節(jié)生存關系

自發(fā)活性能夠影響神經(jīng)細胞生存。自發(fā)活性在神經(jīng)元特殊神經(jīng)遞質的分化過程中起關鍵作用，如神經(jīng)遞質的錯誤表達將導致該神經(jīng)元與正常的神經(jīng)網(wǎng)絡隔離，缺乏突觸信號和營養(yǎng)支持，最終神經(jīng)細胞死亡。

耳蝸內(nèi)毛細胞接受ATP，作用于內(nèi)毛細胞膜上的ATP受體，使內(nèi)毛細胞Ca2+電流內(nèi)流，產(chǎn)生自發(fā)鋒電位，促發(fā)谷氨酸分泌，在這個過程中，需要突觸泡谷氨酸轉運蛋白3(VGLUT3)，將興奮性遞質谷氨酸轉移至突觸泡。Seal等通過觀察培養(yǎng)缺乏VGLUT3的小鼠，得到嚴重聽力損失和癲癇的小鼠，提示VGLUT3作為谷氨酸信號傳遞的重要調控蛋白，對聽力系統(tǒng)和大腦皮質的發(fā)育有重要意義。實驗中VGLUT3缺乏的小鼠在出生后螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的數(shù)量大量減少，并且到腦干神經(jīng)投射也明顯減少。因為VGLUT3發(fā)揮作用是通過影響谷氨酸的分泌實現(xiàn)的，而發(fā)育早期的小鼠耳蝸產(chǎn)生的動作電位能影響谷氨酸的分泌，所以可推測耳蝸早期的自發(fā)活性能影響螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的生存。

Ruan等通過在Corti器中過量表達Kir2.1通道蛋白，比較螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的生存和軸突的生長，來證明耳蝸發(fā)育早期動作電位對聽覺系統(tǒng)的影響。內(nèi)向整流鉀通道Kir2.1能減少鉀離子外流，使毛細胞產(chǎn)生內(nèi)向整流鉀電流，維持細胞的靜息電位使之接近鉀離子的平衡電位并參與動作電位復極化過程，但是過量表達的Kir2.1能使細胞超級化，阻止動作電位的產(chǎn)生。因此用帶有Kir2.1基因的腺病毒轉染Corti器，過量表達的Kir2.1能抑制內(nèi)毛細胞自發(fā)動作電位的產(chǎn)生，和SGNs一起培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)SGNs數(shù)量明顯減少和軸突生長嚴重縮短。而利用神經(jīng)營養(yǎng)因子(IGF-1、BDNF和NT-3等)能逆轉凋亡，并使軸突生長恢復正常。分析其機制可能與耳蝸毛細胞自發(fā)活性介導的SGNs凋亡和神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTFs)釋放有關。由免疫染色和Western blotting得到半胱天冬酶3(細胞凋亡蛋白)表達水平升高，而反應元件結合蛋白(CREB)和BAD的磷酸化水平降低，同時SGNs內(nèi)Ca2+濃度增加，引起細胞的興奮性毒性，這些都與細胞凋亡增加有關。NTFs對SGNs有營養(yǎng)作用，而自發(fā)活性能促進NTFs的分泌。SGNs表面表達有BDNF和NT-3的受體TrkB和TrkC，抑制NTFs或其受體的表達，都會抑制SGNs生長，所以NTFs對SGNs的生存也起到很大的作用。因此，用過量表達的Kir2.1能抑制內(nèi)毛細胞的自發(fā)活性，而自發(fā)活性的缺失降低了早期SGNs的生存并抑制軸突的生長。

三、兩型螺旋神經(jīng)節(jié)外周靶支配發(fā)育和毛細胞自發(fā)活性的作用

螺旋神經(jīng)節(jié)外周靶音頻定位投射發(fā)育經(jīng)歷3個階段:①在出生前的胚胎期，Ⅰ型和Ⅱ型神經(jīng)節(jié)細胞外周樹突生長并同時向內(nèi)毛細胞和外毛細胞投射，基底回兩型螺旋神經(jīng)節(jié)投射至感受高頻音的外周靶細胞，而頂回兩型螺旋神經(jīng)節(jié)投射至感受低頻音的外周靶細胞。發(fā)育早期的形態(tài)原分子，及其他軸突排斥或吸引分子可能參與了這一發(fā)育過程;②在出生后0～3天，軸突純化，形成支配外毛細胞的外螺旋束;③在出生后3～6天，樹突進一步退縮和突觸剪切，消滅Ⅰ型螺旋神經(jīng)節(jié)與外毛細胞形成的突觸，形成支配內(nèi)毛細胞的內(nèi)螺旋束。經(jīng)歷這一發(fā)育過程，內(nèi)毛細胞由Ⅰ型耳蝸神經(jīng)節(jié)支配，而外毛細胞由Ⅱ型感覺神經(jīng)元支配。每一個Ⅰ型神經(jīng)節(jié)細胞僅與一個單獨的內(nèi)毛細胞相接觸，但每個Ⅱ型神經(jīng)節(jié)細胞外螺旋纖維與相對頂回的外毛細胞形成突觸，再轉向基底回支配約30～60個其他外毛細胞。在胚胎晚期，當螺旋神經(jīng)節(jié)細胞外周樹突與外周靶形成突觸后，毛細胞由基底回至頂回依次出現(xiàn)自發(fā)活性。而內(nèi)外毛細胞自發(fā)活性的消失正好與外螺旋束和內(nèi)螺旋束的形成時間相吻合。上述現(xiàn)象說明源于毛細胞的自發(fā)聽覺活性與螺旋神經(jīng)節(jié)及其樹突內(nèi)耳音頻定位投射的正常發(fā)育有密切聯(lián)系。

Karl等認為聽覺系統(tǒng)精確的音頻定位是神經(jīng)環(huán)路純化的結果，而神經(jīng)活性作為指導信號又能影響環(huán)路的純化。但毛細胞自發(fā)活性是否通過突觸傳導和神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌來影響螺旋神經(jīng)節(jié)外周靶音頻定位投射模式的形成尚無相關研究。

在神經(jīng)系統(tǒng)，以活性為基礎的相鄰軸突間的競爭能調節(jié)軸突的生長和分支，對發(fā)育過程中的神經(jīng)環(huán)路純化起重要作用。通過馬賽克樣表達外源蛋白抑制視神經(jīng)節(jié)或嗅神經(jīng)節(jié)細胞軸突電活性或神經(jīng)分泌活性，能明顯抑制單個轉染的神經(jīng)節(jié)細胞軸突的生長和新分支的形成。當相鄰競爭的軸突也被轉染時，軸突的這種抑制將明顯減輕，可見以活性為基礎的軸突間的競爭對神經(jīng)環(huán)路純化起到一定作用。Singh等發(fā)現(xiàn)在競爭的軸突間，活躍的軸突通過NGF介導的CaMKII-MEK信號促進軸突生長，而相對不活躍的軸突通過自分泌或旁分泌的BDNF-p75NTR環(huán)路抑制軸突生長，所以神經(jīng)營養(yǎng)因子可以增強或抑制相鄰軸突間的這種競爭，而神經(jīng)活性又通過影響神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌，進而影響神經(jīng)的達靶支配。

神經(jīng)營養(yǎng)因子通過復雜的信號傳導調節(jié)軸突的生長。神經(jīng)生長因子NT-3和BDNF與對應受體結合能激活PI3激酶，產(chǎn)生磷脂酰肌醇二磷酸 (PIP2)，進而激活PIP3。通過PDK激活Akt(也稱為PKB)，Akt磷酸化GSK-3β使其失活。一方面通過使微管相關蛋白1B(MAP1B)去磷酸化來增加微管的穩(wěn)定性和提高軸突的長度;另一方面GSK-3β的失活使腦衰蛋白反應調節(jié)蛋白-2(CRMP-2)非磷酸化狀態(tài)(活性形式)增加，非磷酸化的CRMP-2結合微管蛋白異二聚體，促進微管穩(wěn)定，從而增加軸突的延伸和分支。

所以，毛細胞自發(fā)活性期間，內(nèi)外毛細胞對兩型傳入神經(jīng)纖維促達靶的可能機制為:毛細胞自發(fā)遞質釋放和神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌通過調節(jié)GSK-3β活性，改變微管和樹突的穩(wěn)定性來對兩型螺旋神經(jīng)節(jié)樹突促達靶進行調節(jié)。

四、展 望

耳蝸內(nèi)自發(fā)活性通過調節(jié)細胞凋亡影響SGNs的生存，并作為指導信號在兩型神經(jīng)節(jié)細胞外周達靶支配的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，但自發(fā)活性影響聽覺系統(tǒng)機制尚需進一步闡明。明確這個重要事件的作用將為聽覺系統(tǒng)發(fā)育過程中聲信號的正確加工提供理論依據(jù);并且，對如何維持和促進先天和后天性耳聾病人神經(jīng)節(jié)細胞生存及其樹突再生和外周靶再支配，與對應的毛細胞建立功能性突觸聯(lián)系，從而改進人工耳蝸置入等治療效果都具重要意義。

1 Syka J.Plastic changes in the central auditory system after hearing loss，restoration of function，and during learning［J］.Physiol Rev，2002，82:601-636

2 Starr A，Picton TW，Sininger Y，et al.Auditory neuropathy［J］.Brain，1996，119(Pt 3):741-753

3 Rodriguez-Ballesteros M，Reynoso R，Olarte M，et al.A multicenter study on the prevalence and spectrum of mutations in the otoferlin gene(OTOF)in subjects with nonsyndromic hearing impairment and auditory neuropathy［J］.Hum Mutat，2008，29:823-831

4 Schwaber MK.Vascular compression syndromes.Jackler RK，Brackmann DE.Neurotology［A］.Philadephia，PA:Elsevier Mosby，2005:892-911

5 Moller AR.Similarities between severe tinnitus and chronic pain［J］.J Am Acad Audiol，2000，11:115-124

6 Henry MA，F(xiàn)reking AR，Johnson LR，et al.Increased sodium channel immunofluorescence at myelinated and demyelinated sites following an inflammatory and partial axotomy lesion of the rat infraorbital nerve［J］.Pain，2006，124:222-233

7 Tritsch NX，Yi E，Gale JE，et al.The origin of spontaneous activity in the developing auditory system［J］.Nature ，2007，450(7166):50-55

8 Harada N.Role of nitric oxide on purinergic signaling in the cochlea［J］.Purinergic Signaling，2010，6(2):211-220

9 Ito K，Dulon D.Purinergic signaling in cochleovestibular hair cells and afferent neurons［J］.Purinergic Signaling，2010，6(2):201-209

10 Knirsch M，Brandt N，Braig C，et al.Persistence of Ca(v)1.3 Ca2+channels in mature outer hair cells supports outer hair cell afferent signaling［J］.J Neurosci，2007，27(24):6442-6451

11 McKay SM，Oleskevich S.The role of spontaneous activity in development of the end bulb of Held synapse［J］.Hearing Research，2007，230(1-2):53-63

12 Marcotti W，Johnson SL，Holley MC，et al.Developmental changes in the expression of potassium currents of embryonic，neonatal and mature mouse inner hair cells［J］.J Physiol，2003，548(2):383-400

13 Sonntag M，Englitz B，Kopp-Scheinpflug C，et al.Early postnatal development of spontaneous and acoustically evoked discharge activity of principal cells of the medial nucleus of the trapezoid body:an in vivo study in mice［J］.J Neurosci，2009，29(30):9510-9520

14 Kros CJ.How to build an inner hair cell:challenges for regeneration［J］.Hear Res，2007，227(1-2):3-10

15 Tritsch NX，Bergles DE.Developmental regulation of spontaneous activity in the mammalian cochlea［J］.J Neurosci，2010，30(4):1539-1550

16 Huang LC，Thorne PR，Housley GD，et al.Spatiotemporal definition of neurite outgrowth，refinement and retraction in the developing mouse cochlea［J］.Development，2007，134(16):2925-2933

17 Ruan Q，Chen D，Wang Z，et al.Topological and developmental expression gradients of Kir2.1，an inward rectifier K+channel，in spiral ganglion and cochlear hair cells of mouse inner ear［J］.Dev Neurosci，2008，30(6):374-388