牙周組織工程研究新進展

孫 路 綜述;王永蘭 審校

(天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院，天津 300070)

牙周病是一種慢性進行性疾病，可導(dǎo)致牙周支持組織的破壞，最終導(dǎo)致牙齒喪失。牙周病治療的目的不僅在于控制炎癥，更在于使已破壞的牙周組織再生以形成新附著。一般來說，完成組織的重建和修復(fù)，需要復(fù)制胚胎發(fā)育和形態(tài)發(fā)育過程，對于牙周組織則需要牙周膜、牙骨質(zhì)、牙槽骨以及牙齦的再生。

牙周骨移植、引導(dǎo)組織再生術(shù)(guided tissue regeneration，GTR)為牙周病治療和牙周缺損修復(fù)帶來新的希望，但在恢復(fù)牙周組織的生理結(jié)構(gòu)和功能上還遠(yuǎn)未達到所期望的目標(biāo)。而組織工程作為重建缺失組織、產(chǎn)生新生組織的技術(shù)，使得實現(xiàn)牙周組織的完全再生成為一種可能，牙周組織工程中的三大基本要素有種子細(xì)胞、信號分子和支架材料，本文就牙周組織工程基本要素及各要素間協(xié)同作用方面內(nèi)容作一綜述。

1 牙周組織工程的種子細(xì)胞來源

作為組織工程三大要素之一，理想的種子細(xì)胞應(yīng)具有以下特點:增殖分化傳代能力強、可塑性強、植入機體后性能穩(wěn)定、對受植區(qū)環(huán)境適應(yīng)能力強、取材簡便，對機體損傷小、無免疫排斥反應(yīng)。

牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)是一組具有多向分化潛能的異質(zhì)性多能干細(xì)胞，能向成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞(cementoblasts，CBs)分化，進而形成牙周膜、牙槽骨和牙骨質(zhì)，形成新的具有功能性的牙周附著結(jié)構(gòu)，因此PDLSCs在牙周組織再生中是具有應(yīng)用前景的種子細(xì)胞之一，并且也被大量的體內(nèi)和體外臨床前期實驗所證實［1-3］。Trubianio 等［4］將 PDLSCs在三維支架材料上培養(yǎng)，向成骨性方面誘導(dǎo)，4周后發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞包裹在礦化基質(zhì)中，表明PDLSCs能較有效地向成骨細(xì)胞(osteoblasts，OBs)分化。Liu等［5］通過外科方法在小豬第一磨牙處移除部分骨組織，隨后在牙頸部周圍用絲線縫合，取小豬自體的PDLSCs通過體外培養(yǎng)擴增移植回小豬的骨缺損處，發(fā)現(xiàn)PDLSCs可以再生牙周組織，為牙周炎的治療提供了一個良好的方法。

然而，由于PDLSCs增殖分化再生的細(xì)胞數(shù)量少，并且自體PDLSCs獲得困難等缺點尚不能滿足于臨床應(yīng)用，而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cell，BMSCs)的多重優(yōu)越特性恰巧彌補其缺陷，與PDLSCs相比，BMSCs具有較強的增殖能力和多向分化潛能，來源豐富，取材簡便，對機體的損失小，因此在臨床上將具有廣泛的應(yīng)用前景［6］。BMSCs在不同的培養(yǎng)條件下，可分別向成骨、成軟骨、成牙骨質(zhì)［7］、成肌細(xì)胞等方向分化。Kim 等［8］從Beagle犬自身取得的BMSCs和PDLSCs分別與羥基磷灰石、β-磷酸三鈣(hydroxyapatite/β-tricalciumphosphate，HA/β-TCP)復(fù)合植入到種植體周圍缺損區(qū)，術(shù)后8周結(jié)果顯示BMSCs組與PDLSCs組的牙槽骨再生量均明顯高于無細(xì)胞的HA/β-TCP對照組，術(shù)后16周結(jié)果顯示，BMSCs組的牙槽骨再生量高于對照組，而PDLSCs組的牙槽骨再生量與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異，證明了BMSCs通過促進骨再生來治療種植體周圍缺損的可行性。

除PDLCs、BMSCs外，牙齦成纖維細(xì)胞(gingival fibroblasts，GFs)作為牙周組織的主要成分，來源豐富、容易獲得、具有很強的生長和自我繁殖能力，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可表達成骨細(xì)胞表型，亦有望成為牙周組織工程的理想種子細(xì)胞［9-10］。牙濾泡細(xì)胞(dental follicle stem cells，DFSCs)在體內(nèi)和體外均有引導(dǎo)鈣化的作用，因此，用DFSCs形成新骨以修復(fù)骨缺損成為一種可能［11］。Tsuchiya 等［12］研究結(jié)果表明:DFSCs與PDLSCs、BMSCs的骨形成能力沒有明顯差別，說明了DFSCs在骨組織工程中具有潛在的應(yīng)用前景。Honda等［13］研究結(jié)果也證實了DFSCs具有促進骨形成的能力。

脂肪干細(xì)胞(adipose tissue-derived stem cells，ADSCs)是近年研究發(fā)現(xiàn)的一種新的成體干細(xì)胞，該細(xì)胞增殖能力強且易獲得，體外培養(yǎng)能保持穩(wěn)定的生長增殖活性，且具有向骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等多向分化潛能，有可能成為牙周組織工程新的種子細(xì)胞。研究表明很多基因具有可以降低或者提高ADSCs的分化能力，如Tbx3，Osx，骨形成蛋白等等。Lee等［14］為了確定 Tbx3在人 ADSCs的表達的作用，通過siTbx3的表達抑制Tbx3進而降低了人ADSCs的增殖能力和向成骨方向分化的能力，表明了Tbx3對于人ADSCs在增殖和向成骨方向分化的方面起著重要作用。Wu等［15］發(fā)現(xiàn)Osx在ADSCs的過度表達增強了骨基質(zhì)蛋白的表達并且不會抑制ADSCs增殖率，同時增強了堿性磷酸酶的活性和礦化結(jié)節(jié)形成的能力，該結(jié)果表明了轉(zhuǎn)染Osx的質(zhì)粒促進了ADSCs向成骨方向分化并且不會影響到其增殖能力，ADSCs在骨組織工程中是有希望的種子細(xì)胞來源。

人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells，hESCs)是近年來干細(xì)胞研究的一個熱點，這類干細(xì)胞具有多向分化潛能，可分化為多種體細(xì)胞。Inan?等［16］將人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells，hESCs)與牙周膜成纖維細(xì)胞共同培養(yǎng)，結(jié)果表明hESCs從某種程度上可定向分化為牙周膜成纖維細(xì)胞前體細(xì)胞，能夠作為牙周組織工程種子細(xì)胞的來源。

2 信號分子與牙周組織工程

信號分子包括生長因子、分化因子、黏附因子等。多種生物活性分子已被證明具有較強的促進牙周組織修復(fù)的功能，包括轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)［17］、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)、骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、秞基質(zhì)衍生物(enamal matrix derivative，EMD)［18-20］等。

Lee等［21］對富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)進行研究，表明適當(dāng)濃度的PRP即能夠促進PDLSCs和牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells，DPSCs)的增殖，又能促進兩種干細(xì)胞向礦化的方向分化，提高了堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性并增加了礦化結(jié)節(jié)的形成。同時通過Real-time PCR檢測到PDLSCs、DPSCs有較高牙源性基因、成骨基因的表達。

bFGF屬于肝素結(jié)合生長因子家族，具有多種生物學(xué)功能，包括血管生成、創(chuàng)傷修復(fù)以及胚胎發(fā)育，已有大量實驗證實bFGF在骨下袋和根分叉病損區(qū)可有效的促進牙周組織再生。Shirakata等［22］分別用 bFGF、EMD、PDGF/β-TCP、翻瓣清創(chuàng)(open flap debridement，OPD)處理beagle犬的實驗性二壁骨下袋病損區(qū)，結(jié)果顯示bFGF組的骨形成量明顯高于EMD和 OPD處理組，EMD和 PDGF、β-TCP兩組的牙骨質(zhì)和牙周韌帶樣組織再生明顯高于OPD組，而 bFGF與 PDGF/β-TCP兩組在組織學(xué)變化上無顯著區(qū)別。

VEGF是一種主要的血管新生調(diào)節(jié)因子，已被廣泛證明:具有極強的促血管增生能力，有研究［23］將血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和血管生成素-1(angiopoietin-1，Ang-1)基因通過兩種腺病毒同時載入至hMSCs，其表達效率和產(chǎn)物為未轉(zhuǎn)載細(xì)胞的2倍，持續(xù)時間達15 d，表達高峰時間達8 d，足以促進血管新生。

然而，外源性生長因子半衰期短，局部使用很快被稀釋和代謝或因為體內(nèi)酶的作用而失活，故需反復(fù)大劑量使用，而且價格非常昂貴，且外源性蛋白的植入可能引起免疫反應(yīng)，基因工程的介入可克服以上缺點［24］。Tan 等［25］將 bFGF 基因轉(zhuǎn)染到beagle犬的BMSCs并移植到beagle犬的根分叉病變處，6周后結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染bFGF基因的BMSCs的牙周骨組織再生速度明顯高于單純移植BMSCs，有效地促進了牙周骨組織的再生。Li等［26］將轉(zhuǎn)染hBMP-7基因的BMSCs復(fù)合膠原膜移植到Beagle犬的Ⅱ度根分叉病變處，術(shù)后12周通過組織學(xué)和形態(tài)學(xué)分析進行牙周組織再生的評估，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染hBMP-7基因的BMSCs組的牙槽骨再生量明顯比未轉(zhuǎn)染基因的BMSCs組的高且具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明hBMP-2基因強化組織工程是治療牙周疾病的較好的方法。

PDGF作為成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞潛在的分裂繁殖和趨化因子，可刺激其膠原蛋白和非膠原蛋白的合成，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞中ALP活性，促進骨的礦化、誘導(dǎo)骨的形成，加速細(xì)胞代謝，促進牙骨質(zhì)再生。Po-Chun Chang等［27］在小鼠的拔牙窩內(nèi)即刻植入含有膠原基質(zhì)的鈦種植體，膠原基質(zhì)中分別含有編碼PDGF-B的腺病毒載體(adenoviral vector encoding PDGF-B，Ad-PDGF-B)、編碼熒光素酶的腺病毒(Ad encoding luciferase，Ad-Luc)和rhPDGF-BB蛋白(recombinant human PDGF-BB protein)，結(jié)果顯示Ad-PDGF-B和rhPDGF-BB較Ad-Luc均加快了骨修復(fù)的進程，表明在體內(nèi)牙槽骨缺損中，Ad-PDGF-B基因表達在骨再生能力和體內(nèi)安全性方面和rhPDGF-BB蛋白表達的作用是相同的。

3 支架材料與牙周組織工程

組織工程核心技術(shù)在于構(gòu)建細(xì)胞與支架材料復(fù)合物，其中支架材料是構(gòu)建組織工程化牙周組織的物質(zhì)基礎(chǔ)。支架材料的主要功能類似于細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，不僅影響細(xì)胞的附著和形態(tài)，還調(diào)控細(xì)胞的正常代謝、遷移、增殖和分化。理想的組織工程支架材料應(yīng)符合以下要求［28-30］:①具有多孔性、適應(yīng)的孔隙率和適宜的表面化學(xué)特性以利于細(xì)胞的附著、增殖和分化;②具有一定的機械強度③具有良好的生物相容性和生物可降解性，且其降解速率可控。目前應(yīng)用于牙周組織工程中的支架材料有很多種，主要有人工合成類材料和天然生物類材料。

3.1 人工合成類材料

聚乳酸-聚羥基乙酸(Polylactide-Polyglycolide，PLGA)是 PLA(Polylactide，聚乳酸)和 PGA(Polyglycolide，聚乙醇酸)的共聚物。由于其具有易于合成、質(zhì)量穩(wěn)定，生物惰性、生物可降解性、降解速度可調(diào)節(jié)性和良好的可塑性等特點近些年來被大量用作控釋系統(tǒng)的骨架材料。有研究［31］將rhBMP-2載入至靜電紡絲制成的PLGA/HAp纖維支架上，且在靜電紡絲過程中rhBMP-2完整性和自身結(jié)構(gòu)未被破壞，rhBMP-2的釋放時間可長達2～8周，其釋放速率也隨著HAp的含量增加而加快。

磷酸三鈣(tricalciumphosphate，TCP)屬于鈣磷鹽陶瓷，有可降解性并且釋放鈣磷離子促進組織礦化，是最常用于骨組織工程的生物支架材料。Stavropoulos等［32］將 β-TCP植入病人的一壁或二壁牙周骨下袋缺損區(qū)，術(shù)后6個月發(fā)現(xiàn)患牙的牙周探診深度、附著喪失均有所減少，并可見新生的含有膠原纖維的牙骨質(zhì)和牙槽骨。Lee等［33］將復(fù)合有重組人生長分化因子-5(recombinant human growth differentiation factor-5，rhGDF-5)的 TCP支架植入beagle犬的下頜前磨牙一壁牙周骨缺損區(qū)處，8周后處死動物經(jīng)組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)rhGDF-5和TCP促進了牙骨質(zhì)和骨的新生，并可見明顯的板狀骨形成，證明了TCP可較好地承載生長因子，是一種良好的牙周組織工程支架材料。

生物活性玻璃(bioactive glass，BG)是一種能夠降解的生物材料，植入牙周組織后，BG與周圍組織發(fā)生離子交換反應(yīng)，出現(xiàn)鈣磷的沉積，形成一個羥基磷灰石層，使BG與牙周骨組織形成界面愈合。Felipe等［34］采用引導(dǎo)組織再生術(shù)將不同直徑的BG顆粒植入狗的二壁牙周骨下袋缺損區(qū)，12周后處死動物取材，組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)有顯著的新骨形成，且直徑較小的BG顆粒的生物降解和新骨形成能力強于直徑較大的BG顆粒。

羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)與人體骨組織的無機成分相似，具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和生物相容性，隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展，nHA應(yīng)運而生，nHA在納米結(jié)構(gòu)上與天然骨極為接近，具有優(yōu)良的生物可降解性和合適的降解速率，其良好的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)保證了種子細(xì)胞的粘附、增殖、分化和營養(yǎng)代謝。Liu等［35］分別將 nHAC/PLA、復(fù)合 rh-BMP-2的nHAC/PLA、復(fù)合 DPSCs的 nHAC/PLA、復(fù)合DPSCs和rhBMP-2的nHAC/PLA以及自體骨(autogenous bone，AB)移植到新西蘭兔的牙槽骨缺損處，12周后處死動物結(jié)果發(fā)現(xiàn) DPSCs在nHAC/PLA上附著伸展良好并保留了成骨原型，nHAC/PLA+DPSCs+rhBMP-2組織工程骨復(fù)合體最早出現(xiàn)礦化并在支架內(nèi)有更多的骨形成。表明了nHAC/PLA可以作為自體DPSCs的接種、增殖和分化的支架，相對自體骨移植而言，復(fù)合DPSCs和rhBMP-2的nHAC/PLA可能會成為臨床牙周骨缺損重建的一個更好選擇。

3.2 天然生物可降解材料

膠原(Collagen)是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，具有生物相容性好、無毒性、促進組織愈合等優(yōu)點。膠原應(yīng)用于牙周再生領(lǐng)域始于20世紀(jì)80年代初，主要用于形成屏障，防止上皮細(xì)胞長入缺損間隙，從而為成骨細(xì)胞創(chuàng)造空間，利于新骨長入，即引導(dǎo)組織再生術(shù)。Ghanaati等［36］通過小鼠模型評估一種具有雙層結(jié)構(gòu)的新型膠原基質(zhì)生物材料，發(fā)現(xiàn)宿主的間充質(zhì)細(xì)胞迅速長入該材料多孔的一層，而作為屏障的一層允許細(xì)胞附著和組織的整合但同時阻擋了細(xì)胞穿過。同時Ghanaati等［36］將該生物材料應(yīng)用到人牙齦退縮和牙根暴露處后發(fā)現(xiàn)該材料成功的促進了牙齦組織的生長并減少了牙齦退縮量，該人體實驗的組織學(xué)結(jié)果進一步印證了小鼠模型的發(fā)現(xiàn)結(jié)果，說明了這種雙層膠原基質(zhì)材料在人的軟組織再生中具有良好的應(yīng)用前景。

殼聚糖(chitosan)是甲殼素類多糖中唯一的堿性氨基多糖，其代謝產(chǎn)物氨基多糖為生物體所需要的物質(zhì)。殼聚糖的特性在于它易與帶負(fù)電的生物物質(zhì)如糖蛋白等結(jié)合，成為聚電解質(zhì)復(fù)合物，因此容易細(xì)胞外基質(zhì)化，適合作為組織工程支架。Boynuegri等［37］將殼聚糖凝膠應(yīng)用于慢性牙周炎病人的牙周骨缺損區(qū)，與單純牙齦翻瓣手術(shù)組相比較，3、6個月后影像學(xué)資料分析顯示其新骨形成量明顯增多。Zhang等［38］將攜帶 BMP-7、PDGF-B、復(fù)合BMP-7和PDGF-B基因腺病毒載體分別接種于殼聚糖膠原支架植入狗下頜骨缺損處，4、8周和12周后可觀察到攜帶 BMP-7、復(fù)合 BMP-7和PDGF-B基因腺病毒載體支架的兩組有明顯的骨形成。

藻酸鹽(alginate)是從海藻中提取出的一種多糖，在鈣離子的作用下交聯(lián)形成網(wǎng)狀晶格凝膠，為高含水率、高彈性和韌性的材料，其三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞的附著及營養(yǎng)和代謝產(chǎn)物的交換。He等［39］將藻酸鈣膜(calcium alginate film，CAF)作為引導(dǎo)骨再生膜植入兔子下頜角的骨缺損區(qū)，以傳統(tǒng)的膠原膜(conventional collagen membrane，CCM)和不置膜作對照，術(shù)后2～6周發(fā)現(xiàn)實驗組與對照組相比可獲得更多的骨再生，術(shù)后6周與8周發(fā)現(xiàn)CAF組比CCM組有更多成熟的板狀骨形成。說明了CAF比CCM作為可吸收性GTR膜引導(dǎo)早期骨的生長更有效，作為治療骨缺損的組織工程材料有更好的應(yīng)用前景。

總之，牙周組織工程技術(shù)治療牙周缺損的修復(fù)再生有著巨大的潛力和廣闊的前景，但此研究尚處于初級階段，還有許多問題亟待解決。深入進行支架材料和種子細(xì)胞的研究和開發(fā)，構(gòu)建理想的支架材料-細(xì)胞復(fù)合體;建立和完善牙周組織工程動物實驗?zāi)Ｐ?選擇合理的生長因子組合和研制新型載體-控釋系統(tǒng)是牙周組織工程研究的方向;對于基因治療應(yīng)用于臨床的安全性和有效性，仍有待進一步研究。同時需要多學(xué)科、跨專業(yè)的技術(shù)聯(lián)合與協(xié)作，最終實現(xiàn)由基礎(chǔ)實驗到臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)變這一目標(biāo)。

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