乳腺癌基因治療的研究進(jìn)展

杜力成，王 棟(綜述)，劉 奇※，田興松(審校)

(山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院1乳腺甲狀腺外科，2胸外科，濟(jì)南250021)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤?；蛑委熓抢^手術(shù)、放化療以及內(nèi)分泌治療之后的一種新興治療手段，與傳統(tǒng)的治療模式相比，有更好的靶向性、針對性，更適于對乳癌患者實施個體化治療。近年來，隨著對腫瘤分子病理學(xué)認(rèn)識的不斷深入，乳腺癌的基因治療研究快速發(fā)展，某些靶向藥物已成功應(yīng)用于臨床并取得了良好的效果?，F(xiàn)就乳腺癌基因治療的相關(guān)情況予以綜述。

1 自殺基因治療

自殺基因是指能將無毒的藥物前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性物質(zhì)的基因。轉(zhuǎn)入自殺基因的腫瘤細(xì)胞可以被前藥的有毒代謝產(chǎn)物選擇性破壞。旁觀者效應(yīng)是另一作用機(jī)制，是指除了破壞那些整合了自殺基因的腫瘤細(xì)胞外，自殺基因?qū)︵徑奈幢晦D(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞也有破壞作用，從而大大提高了該治療對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力［1］。

單純皰疹病毒胸苷激酶基因(herpes simplex virus thymidine kinase，HSV-tk)/更昔洛韋(ganciclovir，GCV)或阿昔洛韋(acyclovir，ACV)是研究最多的自殺基因系統(tǒng)。GCV/ACV通過HSV-tk的磷酸化作用變?yōu)榱姿猁}形式，抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)DNA多聚酶活性，靶向干擾轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的生長。Sacco等［2］建立了轉(zhuǎn)雙基因小鼠(neu/HSV-tk)及轉(zhuǎn)單基因小鼠(neu)并進(jìn)行乳腺癌成瘤實驗，之后用GCV進(jìn)行瘤內(nèi)注射，結(jié)果顯示，GCV治療對轉(zhuǎn)雙基因小鼠的腫瘤生長速度有抑制作用，而對轉(zhuǎn)單基因小鼠的腫瘤生長無影響，證實了HSV-tk處理可以激活乳腺癌細(xì)胞對GCV的敏感性。Shibata等［3］用電穿孔法轉(zhuǎn)染HSV-tk基因并加用GCV干預(yù)，進(jìn)一步證實HSV-tk/GCV治療可以抑制乳腺癌生長，降低淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移率，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

此后，越來越多的自殺基因系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于科研及臨床治療。AQ4N(banoxantrone)是一種新近發(fā)現(xiàn)的無毒藥物前體，在乏氧的腫瘤組織中可以激活為細(xì)胞毒素AQ4，抑制腫瘤細(xì)胞拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性。Albertella等［4］對32例惡性腫瘤患者(包括6例乳腺癌患者)靜脈應(yīng)用200 mg/m2劑量AQ4N，之后檢測藥物濃度，發(fā)現(xiàn)高濃度的AQ4選擇性地聚集在腫瘤組織中，而在正常組織中含量極低，提示AQ4N是一種較為安全的自殺基因治療前藥。

2 癌基因拮抗治療

癌基因拮抗治療可通過抑制原癌基因功能和恢復(fù)抑癌基因功能兩種途徑實現(xiàn)。惡性腫瘤是由于原癌基因異常激活導(dǎo)致的基因疾病，通過抑制癌基因的表達(dá)及其產(chǎn)物的生物學(xué)活性可以達(dá)到治療腫瘤的目的。目前研究最多的乳腺癌基因是人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER-2)基因。HER-2基因又稱c-erbB-2基因，其擴(kuò)增及過表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生、早期轉(zhuǎn)移及對激素或非蒽環(huán)類藥物耐藥性有關(guān)。Herceptin(赫賽汀)是重組的抗HER-2受體的單克隆抗體，已于1998年由美國食品藥品管理局批準(zhǔn)上市［5］。Herceptin可用于HER-2基因陽性表達(dá)的乳腺癌患者，單藥有效率達(dá)35%。與化療藥物，如長春瑞賓、紫杉醇等聯(lián)合應(yīng)用，可以提高治療的有效率，延長患者生存時間［6］。Herceptin作為一種靶向性基因治療藥物，針對性殺傷HER-2基因陽性的惡性腫瘤細(xì)胞，而不影響正常細(xì)胞的生存，為HER-2陽性乳腺癌患者提供了較為安全可靠的臨床治療方法，是目前較為成功的靶向抗癌治療研究范例。除了抑制原癌基因的激活和表達(dá)，癌基因拮抗治療還包括重建抑癌基因的功能。p53基因是研究最多和較為深入的一種抑癌基因。野生型p53蛋白充當(dāng)“分子警察”，使有癌變傾向的細(xì)胞消亡。突變的p53基因不僅引起p53抑癌活性的丟失，還促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，從而由抑癌基因轉(zhuǎn)化為癌基因。在癌癥患者中，半數(shù)以上存在p53基因突變，而在乳腺癌患者中，則有20%～35%可以檢測到p53突變體［7-8］。p53基因的異常表達(dá)與乳腺癌發(fā)生、復(fù)發(fā)和預(yù)后不良有關(guān)［9］。Dummer等［10］對乳腺癌患者進(jìn)行了p53基因治療的Ⅰ期臨床試驗，發(fā)現(xiàn)以腺病毒載體攜帶野生型p53基因?qū)肴巳橄侔┙M織后引發(fā)了人體的抗瘤效應(yīng)。美國安德森癌癥中心對重組p53-腺病毒制品advexin進(jìn)行了乳腺癌治療的臨床試驗，觀察advexin與兩種化療藥物(多西他賽、阿霉素)聯(lián)合使用對局部晚期乳腺癌的療效。經(jīng)過4個月的臨床試驗，90%的患者出現(xiàn)腫瘤完全消退或部分消退［11-12］。

BRCA-1是另一種與乳腺癌有密切關(guān)系的抑癌基因。在家族性乳腺癌的患者中，BRCA-1基因缺陷率高達(dá)90%［9］。這類患者也常伴有p53基因突變。根據(jù)上述理論，Liu等［13］構(gòu)建了一種BRCA-1基因缺陷的動物模型，該模型同時含有BRCA-1和p53基因的突變，其分子生物學(xué)特性與人類BRCA-1基因缺陷的遺傳性乳腺癌類似，表現(xiàn)出增殖快、分化低、ER(－)等一系列特點及很強(qiáng)的遺傳不穩(wěn)定性，驗證了BRCA-1基因缺陷在人類乳腺癌發(fā)病過程中的作用，提示BRCA-1基因靶向治療有望成為乳腺癌治療的有效方法［14-15］。

3 抗血管生成治療

新生血管生成是惡性腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)，直徑2～3 mm以上的實體腫瘤必須依靠新生血管的供養(yǎng)才能繼續(xù)生長。血管發(fā)生與很多生物因子，如血管生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、成纖維細(xì)胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子α和β等密切相關(guān)。

VEGF是迄今發(fā)現(xiàn)的活性最強(qiáng)的血管生長調(diào)節(jié)因子，腫瘤細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞通過分泌VEGF促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的分裂、增殖及遷移，增強(qiáng)血管透性，是目前研究最多的抗新生血管治療分子靶。使用抗VEGF配體/受體的抗體或VEGF受體抑制劑理論上都可以達(dá)到治療目的。Wilmes等［16］應(yīng)用 VEGF受體酪氨酸激酶抑制劑AG-013736對接種乳腺癌的裸鼠進(jìn)行治療，7 d后用動態(tài)增強(qiáng)磁共振成像觀察療效，并進(jìn)行病理學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，治療組腫瘤生長明顯受到抑制，腫瘤微血管密度明顯減少，血管通透性明顯降低，壞死及死亡細(xì)胞數(shù)增加。

貝伐單抗是重組的人VEGF的單克隆抗體，通過特異性結(jié)合VEGF配體、阻止其與受體結(jié)合而發(fā)揮抗癌作用，是第一種基于抗血管生成理論研發(fā)的惡性腫瘤治療藥物。Wedam等［17］用貝伐單抗對21例晚期乳腺癌患者進(jìn)行治療，并進(jìn)行分子生物學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)貝伐單抗治療可以抑制VEGF受體活性、內(nèi)皮細(xì)胞增殖以及血管通透性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

4 基因免疫治療

基因免疫治療的目的是在基因水平刺激宿主的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗腫瘤免疫。其主要策略是通過基因重組技術(shù)，導(dǎo)入細(xì)胞因子基因以提高機(jī)體抗瘤能力，或通過表達(dá)腫瘤細(xì)胞缺乏的某些分子以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性，激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)和(或)增強(qiáng)機(jī)體針對腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associated antigen，TAA)的特異性免疫。

近來有報道利用樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)的高抗原呈遞性，將腫瘤抗原的編碼基因轉(zhuǎn)染DC，DC持續(xù)表達(dá)并呈遞腫瘤抗原，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生CD4+和CD8

+T細(xì)胞特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答。Wang等［18］將攜帶多種TAA的慢病毒載體(lentiviral vector，LV)修飾DC細(xì)胞并對荷瘤鼠進(jìn)行免疫，發(fā)現(xiàn)該腫瘤疫苗(LV-TAA-DC)具有強(qiáng)抑瘤作用，治療后實驗組小鼠體內(nèi)干擾素γ水平增高，細(xì)胞毒性T細(xì)胞效應(yīng)增強(qiáng)，小鼠生存時間延長。同理，也可以將抗腫瘤免疫相關(guān)細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)入DC細(xì)胞，從而增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫，達(dá)到治療目的。Bontkes等［19］將TAA和白細(xì)胞介素12的mRNA共轉(zhuǎn)染入DC細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)該腫瘤疫苗能夠誘導(dǎo)自然殺傷細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫應(yīng)答。

5 溶瘤病毒治療

溶瘤病毒治療原理是通過對自然界存在的一些致病力較弱的病毒進(jìn)行基因改造制成特殊的溶瘤病毒，利用靶細(xì)胞中抑癌基因的失活或缺陷從而選擇性地感染腫瘤細(xì)胞，在其內(nèi)大量復(fù)制并最終摧毀腫瘤細(xì)胞。在腫瘤細(xì)胞溶脹死亡后釋放出的病毒可繼續(xù)感染其他腫瘤細(xì)胞，同時這些病毒因無法在正常機(jī)體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制而不具有殺傷作用。因而，理論上溶瘤病毒治療具有較高的效率和較低的不良反應(yīng)。

ONYX-015是一種缺失編碼區(qū)E1B-55 kd的腺病毒突變株，野生型p53基因可與該段編碼區(qū)E1B-55 kd特異性結(jié)合，從而阻止ONYX-015基因轉(zhuǎn)錄。ONYX-015只能選擇性地在p53基因缺陷的腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并破壞該細(xì)胞，對于正常細(xì)胞無影響。目前，對溶瘤病毒ONYX-015的腫瘤治療的研究多集中在頭頸部腫瘤。2002年，Kenzer等［20］對 ONYX-015治療乳腺癌進(jìn)行了初步研究，選擇5例乳腺癌胸壁復(fù)發(fā)瘤患者進(jìn)行病灶局部注射并觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2例患者出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)腺病毒感染，其中1例腫瘤組織內(nèi)出現(xiàn)壞死，而在正常細(xì)胞內(nèi)未發(fā)現(xiàn)病毒感染征象。多個臨床試驗均顯示溶瘤病毒具有良好的治療效果，與放化療結(jié)合應(yīng)用時抗瘤效應(yīng)增強(qiáng)，該治療手段耐受性良好，毒性低，不良反應(yīng)較少［21-23］。

6 反義基因治療及RNA干擾技術(shù)

反義基因治療是以反義寡核苷酸或表達(dá)反義mRNA的載體導(dǎo)入細(xì)胞以校正基因表達(dá)異常。由于反義治療的靶向為特定序列，特異性高，不良反應(yīng)少。Suzuki等［24］設(shè)計了抗乳腺癌 HER-2基因的核酶，并重組入腺病毒載體，對荷瘤裸鼠進(jìn)行注射，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該制劑明顯抑制了乳腺癌組織的生長。

RNA干擾是在反義基因研究中意外獲得的重大科學(xué)突破，由此而衍生的RNA干擾技術(shù)已發(fā)展成為一種全新的基因阻斷技術(shù)，并成為乳腺癌基因治療的研究熱點。Hu等［25］應(yīng)用攜帶 HER-2基因干擾RNA的質(zhì)粒載體(HER2-shRNAs)對乳腺癌細(xì)胞株的體外生長及體內(nèi)成瘤作用進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)HER2-shRNAs能夠降低HER-2基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)量，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，增加腫瘤細(xì)胞凋亡，并抑制實驗鼠種植瘤的生長，與表柔比星聯(lián)合使用具有協(xié)同作用。

7 其他抗乳腺癌基因治療策略

近年來多種其他基因治療策略也被成功地用于乳腺癌基因治療的實驗研究中，如導(dǎo)入二氫葉酸還原酶基因以耐受甲氨蝶呤的化療，或?qū)攵嗨幠退幓蛞阅褪芏喾N化療劑等;將凋亡相關(guān)基因(如Fas基因等)導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞或干擾凋亡抑制基因的功能(如 survinvin基因等)，以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡等［26-27］。

腺病毒的E1A基因是近年來研究較多的與腫瘤凋亡相關(guān)的基因。研究發(fā)現(xiàn)，E1A基因能夠抑制HER-2基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡［28］。美國 MD-Anderson腫瘤中心的 Hortobagyi等［29］對E1A基因治療轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)性乳腺癌患者進(jìn)行了臨床Ⅰ期試驗，實驗人員利用脂質(zhì)體包裹的E1A基因?qū)?例乳腺癌患者進(jìn)行每周1次的胸腔或腹腔注射，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療后腫瘤細(xì)胞HER-2表達(dá)水平降低，癌細(xì)胞的凋亡率增加，而瘤細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制及增殖明顯受到抑制。

8 問題與展望

近年來，生物技術(shù)的迅速發(fā)展使腫瘤的基因治療不斷取得新的突破，尤其是針對乳腺癌患者的基因治療藥物Herceptin的問世。然而，要使基因治療真正成為乳腺癌綜合治療的一部分，并廣泛用于臨床還有很多問題:①缺乏高效的、特異的導(dǎo)向性載體，因此開發(fā)新的、高效的、特異的持續(xù)表達(dá)靶向載體已成為今后基因治療研究的重要課題。②基因表達(dá)的可控性及安全性問題，因而現(xiàn)在的研究趨向于用組織和腫瘤特異性基因啟動子控制靶基因的表達(dá)，以此來提高基因治療的效率，減輕其不良反應(yīng)。③基因治療用于人體時的倫理學(xué)問題以及劑量、途徑、安全性等問題也需要全社會的關(guān)注和進(jìn)一步探索、解決。到目前為止，一些乳腺癌致病的關(guān)鍵基因或啟動環(huán)節(jié)尚未最終明確，因而尋找乳腺癌致病的關(guān)鍵基因或探討多基因聯(lián)合治療的途徑及方法，真正發(fā)揮多基因聯(lián)合治療的協(xié)同作用，并使之應(yīng)用于臨床是乳腺癌基因治療研究的方向。

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