誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞技術(shù)的研究進(jìn)展

李姝汶(綜述)，郭紅宇，王志平(審校)

(1.蘭州大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，蘭州730107;2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院產(chǎn)科，蘭州730107;3.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，蘭州730107)

誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPS)是通過(guò)在分化的體細(xì)胞中表達(dá)特定的幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，以誘導(dǎo)體細(xì)胞的重編程而獲得的可不斷自我更新且具有多向分化潛能的細(xì)胞。由于其在研究疾病機(jī)制，藥物篩選以及疾病治療領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力，iPS技術(shù)的發(fā)現(xiàn)被列為“21世紀(jì)十大科技成就”之一，并迅速成為科學(xué)研究的新熱點(diǎn)。

1 多能誘導(dǎo)干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展

1.1 轉(zhuǎn)錄因子的選擇 2006年，Takahashi等［1］通過(guò)導(dǎo)入反轉(zhuǎn)錄病毒異位表達(dá) Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4因子誘導(dǎo)鼠成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為多能干細(xì)胞狀態(tài)，第一次建立鼠類(lèi) iPS細(xì)胞系。此后，Yu等［2］和Takahashi等［3］也運(yùn)用類(lèi)似方法成功誘導(dǎo)人類(lèi)iPS細(xì)胞。自此，iPS細(xì)胞技術(shù)在短短幾年內(nèi)就被廣泛研究并獲得了快速的發(fā)展。

最初研究者所使用的轉(zhuǎn)錄因子是Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4，c-Myc的致癌性使這種技術(shù)應(yīng)用于臨床存在很高的風(fēng)險(xiǎn)。無(wú)c-Myc的iPS成功建系表明Myc基因在人和鼠的基因重組中并非必要，改進(jìn)后重編程的效率大大降低［4-8］。2008 年，Kim 等［9］發(fā)現(xiàn)成鼠神經(jīng)干細(xì)胞高表達(dá)內(nèi)源性Sox2和 c-Myc，只需導(dǎo)入Oct4聯(lián)合Klf4或c-Myc兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子就可以成功誘導(dǎo)出小鼠iPS細(xì)胞，說(shuō)明在誘導(dǎo)iPS細(xì)胞時(shí)，結(jié)合高表達(dá)的內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子可以減少外源轉(zhuǎn)錄因子的使用數(shù)量，這大大降低了外源轉(zhuǎn)錄因子可能帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)。最近，Kim 等［10］首次證明了只使用一種轉(zhuǎn)錄因子Oct3/4即可成功誘導(dǎo)iPS細(xì)胞，但其效率很低。

1.2 載體的發(fā)展 重編程的誘導(dǎo)是將外源轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入目的細(xì)胞，啟動(dòng)內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，重編程的維持是依靠?jī)?nèi)源性因子。目前使用的載體主要為反轉(zhuǎn)錄病毒，而反轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體攜帶目的基因整合至宿主基因組能夠確保重編程所需目的蛋白高效集中地表達(dá)，可能導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生插入突變或引發(fā)致癌基因的表達(dá)。因此，科學(xué)家也在積極開(kāi)發(fā)無(wú)需整合的基因載體來(lái)誘導(dǎo)重編程，如腺病毒［11］和質(zhì)粒［12］。

減少載體數(shù)量也能夠降低整合造成的致癌概率。Carey等［13］用含有2A縮氨酸遺傳代碼的DNA將4種重組基因串聯(lián)起來(lái)的方法獲得了有能力表達(dá)多個(gè)基因的多順?lè)醋有缘穆《荆瑢⒉《据d體數(shù)目從4個(gè)減少到1個(gè)，從而極大地簡(jiǎn)化了iPS的誘導(dǎo)。這項(xiàng)重要進(jìn)展的推廣面臨著幾個(gè)限制因素:①需要對(duì)蛋白進(jìn)行多次復(fù)雜的提純;②減慢了重組動(dòng)力;③重組效率低。

1.3 iPS細(xì)胞技術(shù)派生方法學(xué)的發(fā)展 為了消除外源轉(zhuǎn)錄因子重新活化而帶來(lái)的危險(xiǎn)性，很多研究者嘗試在外源轉(zhuǎn)錄基因發(fā)生基因沉默后將其從基因組中去除。Cre/LoxP重組體系能夠成功切除已經(jīng)轉(zhuǎn)染的目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)的整合基因，去除復(fù)雜的轉(zhuǎn)座子是一個(gè)費(fèi)力復(fù)雜的過(guò)程，即使成功了，這個(gè)策略也會(huì)留下導(dǎo)致載體序列發(fā)生突變的潛在后遺癥［14］。近期有在鼠細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因無(wú)痕剪切的報(bào)道，這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用了PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，這項(xiàng)技術(shù)在人類(lèi)細(xì)胞中的進(jìn)展十分緩慢［15］。

近期有研究者在重編程過(guò)程中加入一些小分子干涉RNAs(siRNAs)或微小RNAs(miRNAs)，發(fā)現(xiàn)這些小分子能夠取代一些重編程因子或提高重編程的速度和效率，可能產(chǎn)生更加安全的iPS細(xì)胞。Huangfu等［16-17］發(fā)現(xiàn)組氨酸脫乙酰酶抑制劑丙戊酸能夠提高重組效率達(dá)100倍并能促進(jìn)僅有Oct4和Sox2誘導(dǎo)的重編程。Zhao等［18］表明，p53 siRNAs大大提高了經(jīng)典Yamanaka 4因子體系的誘導(dǎo)效率。Ichida等［19］最近發(fā)現(xiàn)一種小分子抑制劑轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β信號(hào)可以代替Sox2，誘使Nanog表達(dá)來(lái)啟動(dòng)重編程。iPS細(xì)胞中被上調(diào)的miRNA也可能對(duì)重編程有促進(jìn)或抑制作用［20］?？傊?，以iPS細(xì)胞派生的方法學(xué)的迅速發(fā)展，改善了現(xiàn)有的iPS技術(shù)，這些分子水平基因重排的促進(jìn)作用的具體機(jī)制仍不明確。

1.4 原始細(xì)胞的選擇 早期研究者使用成纖維細(xì)胞進(jìn)行重編程，近期其他研究小組也用其他來(lái)源于3種不同胚層的體細(xì)胞進(jìn)行了嘗試，包括B淋巴細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、角蛋白細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、外周血細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞等［9，21-24］。

Kim等［25］報(bào)道了人胎兒神經(jīng)干細(xì)胞能夠只用Oct4因子就能實(shí)現(xiàn)重編程。鑒于獲取這種細(xì)胞需要侵入性的手術(shù)，目前不能作為誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的穩(wěn)定來(lái)源。神經(jīng)干細(xì)胞可以作為更好且更加簡(jiǎn)便的平臺(tái)來(lái)獲取iPS細(xì)胞以及動(dòng)物疾病模型，這為研究iPS細(xì)胞移植、人類(lèi)疾病機(jī)制以及藥物研發(fā)都提供了很好的工具。

Utikal等［26］利用人初級(jí)黑色素細(xì)胞作為起始細(xì)胞進(jìn)行重編程，正如皮膚成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞一樣，黑色素細(xì)胞也是在特殊條件下經(jīng)皮膚活檢組織培養(yǎng)體外而來(lái)。這種細(xì)胞有高水平的Sox2因子表達(dá)，因此只需要另外3種因子(Oct4、Klf4、c-MYC)來(lái)誘導(dǎo)重編程，因?yàn)樵撗芯克玫暮谏丶?xì)胞的供體年齡并不明確，因此關(guān)于成人的黑色素細(xì)胞重編程的效率和速度并不清楚。盡管如此，利用黑色素細(xì)胞通過(guò)較少的細(xì)胞因子以及非集成化的技術(shù)為提高獲得iPS細(xì)胞的安全性提供了一個(gè)很好的機(jī)會(huì)。

近期有兩篇文章報(bào)道了利用臍帶血細(xì)胞成功誘導(dǎo)iPS細(xì)胞。Giorgetti等［27］僅利用Oct4和Sox2兩種轉(zhuǎn)錄因子將從臍帶血細(xì)胞中分離的CD133+細(xì)胞誘導(dǎo)成iPS細(xì)胞，利用低溫冷藏了5年的臍帶血所分離的細(xì)胞也誘導(dǎo)成功。Haase等［28］利用臍帶血來(lái)源的內(nèi)皮細(xì)胞外加 Thomson 4因子(Oct4、Sox2、Nanog、Lin28)誘導(dǎo)出iPS細(xì)胞。臍帶血含有包括造血干細(xì)胞在內(nèi)的許多不同種類(lèi)的細(xì)胞，因此要用臍帶血細(xì)胞作為iPS細(xì)胞的來(lái)源就需要患者出生時(shí)儲(chǔ)存臍帶血。目前科學(xué)界不明確臍帶血究竟能凍存多久還能保持其重編程的能力，所以這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用前應(yīng)對(duì)凍存了幾十年的臍帶血進(jìn)行重編程能力測(cè)定。

靶細(xì)胞不同，重組的概率就不同，如造血干細(xì)胞重組效率高于末端分化的B細(xì)胞和T細(xì)胞［29］。不同來(lái)源的細(xì)胞具有不同的分化性質(zhì)。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自肝細(xì)胞的iPS細(xì)胞更傾向于分化為畸胎瘤而非神經(jīng)元細(xì)胞及其前體［30］?？傊?，不同類(lèi)型細(xì)胞的重組效率、動(dòng)力學(xué)和重組分化潛能都有很大差別，實(shí)際應(yīng)用可能導(dǎo)致療效的差異。

2 多能誘導(dǎo)干細(xì)胞在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中的新進(jìn)展

iPS細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞在基因表達(dá)、DNA甲基化、胚狀體、活嵌合體方面都完全相同，具有生成所有胚層細(xì)胞并繼續(xù)分化為多種成體細(xì)胞的能力。因此，這項(xiàng)技術(shù)最有潛力的應(yīng)用前景是產(chǎn)生疾病或個(gè)體特異的多能干細(xì)胞，用于研究組織功能、篩選新藥和移植治療遺傳或退行性疾病。

目前疾病特異性iPS細(xì)胞的培養(yǎng)也已經(jīng)在其他十余種基因疾病中實(shí)現(xiàn)，包括帕金森病、1型糖尿病、肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、腺苷脫氨酶缺乏有關(guān)嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷、Gaucher?、笮汀⒑嗤㈩D舞蹈癥、唐氏綜合征、自毀容貌癥［31］。這些細(xì)胞系不僅可以作為外模型用來(lái)研究相應(yīng)疾病，同時(shí)也可以作為細(xì)胞替換療法的一種潛在的細(xì)胞來(lái)源。

2.1 血液遺傳病 2009年，Ye等［32］用包含4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因(Oct4、Sox2、Klf4、cMyc)的反轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染β珠蛋白障礙性貧血患者的皮膚誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞重編程為iPS，發(fā)現(xiàn)這些iPS細(xì)胞可以分化成造血干細(xì)胞并進(jìn)一步生成血細(xì)胞，表明使用iPS技術(shù)進(jìn)行早期細(xì)胞治療能夠?yàn)橹榈鞍咨烧系K性貧血胎兒圍生期治療提供新的方法。

2.2 肝臟疾病 研究發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞來(lái)源的iPS細(xì)胞可以恢復(fù)酵素水解酶缺陷型小鼠的肝功能，證明了iPS細(xì)胞分化而來(lái)的肝細(xì)胞不僅能夠重新回到肝臟，且可修復(fù)肝功能的損壞［31］。這項(xiàng)研究加深了研究者對(duì)體內(nèi)情況下iPS細(xì)胞分化為肝細(xì)胞潛力的了解以及用患者肝細(xì)胞建立體外疾病模型的應(yīng)用。

2.3 心血管疾病 另有實(shí)驗(yàn)表明iPS細(xì)胞可以分化為組成心血管的主要細(xì)胞類(lèi)型，包括平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管壁細(xì)胞以及心肌細(xì)胞［33-35］。通過(guò)人的胚胎干細(xì)胞和iPS細(xì)胞分化而來(lái)的心肌細(xì)胞已被用于藥物毒性測(cè)試，如藥物引起Q-T間期延長(zhǎng)導(dǎo)致的突發(fā)性心跳停止，而這恰好是制藥公司最為關(guān)注的安全問(wèn)題［36］。

2.4 神經(jīng)退行性疾病 Dimos等［37］成功地從一個(gè)患有家族肌萎縮側(cè)索硬化癥且伴有超氧化物歧化酶1變異的老年患者身上獲取體細(xì)胞并誘導(dǎo)成iPS細(xì)胞，這些iPS細(xì)胞分化為帶有典型標(biāo)志物Hb9和胰島素基因增強(qiáng)結(jié)合蛋白1的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞。雖然脊髓性肌萎縮癥和肌萎縮側(cè)索硬化癥都屬于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元神經(jīng)退行性疾病，但只有脊髓性肌萎縮癥患者的iPS細(xì)胞所分化而成的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元有相應(yīng)癥狀。這可能是因?yàn)榧∥s側(cè)索硬化癥基本都是中年以后發(fā)病，而脊髓性肌萎縮癥基本都是兒童期發(fā)病。此外，也可能是由于神經(jīng)退行性疾病模型所采用的iPS細(xì)胞是來(lái)自于具有常染色體隱性遺傳脊髓性肌萎縮癥和家族性自主神經(jīng)異常的患者。

2010年，Amoh等［38］研究發(fā)現(xiàn)毛囊誘導(dǎo)干細(xì)胞可以形成神經(jīng)元和其他細(xì)胞類(lèi)型，移植的毛囊干細(xì)胞促進(jìn)周?chē)窠?jīng)功能恢復(fù)和脊髓受傷，因此成人毛囊干細(xì)胞的治療應(yīng)用尤其是對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療，有了潛在的臨床實(shí)用性。這些研究為神經(jīng)退行性疾病機(jī)制以及藥物的研發(fā)開(kāi)辟了新的道路。

3 問(wèn)題與展望

由于iPS細(xì)胞自身的特性，既可用于研究組織功能和篩選新藥，也可用于移植治療遺傳或退行性疾病，不僅避免了免疫排斥及倫理問(wèn)題，還可以產(chǎn)生新的治療方法。iPS細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用在臨床實(shí)踐前，仍然面臨著一些重要的挑戰(zhàn):①iPS細(xì)胞誘導(dǎo)方法仍存在諸多不足，尚待改進(jìn)。以經(jīng)典的反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)重排的人類(lèi)iPS細(xì)胞生成效率低，僅有0.001%～0.01%;用于重組病毒載體的重組基因是已知的致癌基因，特別是c-Myc、Oct4和Klf4產(chǎn)生的iPS細(xì)胞不可能安全地被用于臨床。一些新技術(shù)的發(fā)展，包括無(wú)病毒整合的重組質(zhì)?；蛑苯又亟M等蛋白質(zhì)技術(shù)以及化學(xué)或包括蛋白在內(nèi)的小分子誘導(dǎo)的辦法，就有可能解決這些問(wèn)題。②iPS細(xì)胞自身安全性有待提高，尚未達(dá)到“臨床級(jí)別”。同其他來(lái)源的干細(xì)胞一樣，iPS細(xì)胞自身也具有潛在危險(xiǎn)性，如畸胎瘤的形成、異常重編程等。因此，iPS細(xì)胞的任何臨床試驗(yàn)和治療應(yīng)用前應(yīng)首先確定統(tǒng)一的鑒定iPS安全性的標(biāo)準(zhǔn)，并在適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型上經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的測(cè)試。③未來(lái)進(jìn)行患者自體特異性iPS細(xì)胞的生產(chǎn)以及臨床治療時(shí)要慎重考慮選擇哪一種類(lèi)型的細(xì)胞進(jìn)行重編程。從患者身上分離進(jìn)行重編程的理想的細(xì)胞來(lái)源應(yīng)符合以下標(biāo)準(zhǔn):容易取得且手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)小;獲取量要足夠大;擁有較高的重編程效率;重編程后的iPS細(xì)胞具有較快的分裂速度。為確保iPS細(xì)胞技術(shù)在臨床前研究及臨床應(yīng)用，還應(yīng)開(kāi)發(fā)體內(nèi)追蹤細(xì)胞命運(yùn)軌跡的新技術(shù)，以探索iPS細(xì)胞的療效及后期影響。④在倫理方面。iPS細(xì)胞雖然避免了從人類(lèi)胎盤(pán)獲取的爭(zhēng)議，但是并不代表在道德層面不受質(zhì)疑。iPS細(xì)胞可以從活體捐贈(zèng)者身體組織中取得，對(duì)捐贈(zèng)者的跟蹤接觸可能接觸到道德和法律底線(xiàn)，用這種方式研究取得成果的發(fā)表也可能觸犯捐贈(zèng)者的健康和權(quán)利。

盡管利用iPS細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用于臨床治療面臨著很多困難，一旦實(shí)現(xiàn)可行、安全、高效、無(wú)病毒、無(wú)轉(zhuǎn)基因的自體iPS細(xì)胞技術(shù)這一研究領(lǐng)域的最終目標(biāo)，必將給醫(yī)學(xué)研究及多種疾病治療帶來(lái)深遠(yuǎn)的影響。

［1］Takahashi K，Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors［J］.Cell，2006，126(4):663-676.

［2］Yu J，Vodyanik MA，Smuga-Otto K，et al.Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells［J］.Science，2007，318(5858):1917-1720.

［3］Takahashi K，Tanabe K，Ohnuki M，et al.Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors［J］.Cell，2007，131(5):861-872.

［4］Wernig M，Meissner A，Cassady JP，et al.c-Myc is dispensable for direct reprogramming of mouse fibroblasts［J］.Cell Stem Cell，2008，2(1):10-12.

［5］Nakagawa M，Koyanagi M，Tanabe K，et al.Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts［J］.Nat Biotechnol，2008，26(1):101-106.

［6］Martinez-Fernandez A，Nelson TJ，Ikeda Y，et al.c-MYC independent nuclear reprogramming favors cardiogenic potential of induced pluripotent stem cells［J］.J Cardiovasc Transl Res，2010，3(1):13-23.

［7］Araki R，Hoki Y，Uda M，et al.Crucial role of c-Myc in the generation of induced pluripotent stem cells［J］.Stem Cells，2011，29(9):1362-1370.

［8］Aoki T，Ohnishi H，Oda Y，et al.Generation of induced pluripotent stem cells from human adipose-derived stem cells without c-MYC［J］.Tissue Eng Part A，2010，16(7):2197-2206.

［9］Kim JB，Zaehres H，Wu G，et al.Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors［J］.Nature，2008，454(7204):646-650.

［10］Kim JB，Zaehres H，Arauzo-Bravo MJ，et al.Generation of induced pluripotent stem cells from neural stem cells［J］.Nat Protoc，2009，4(10):1464-1470.

［11］Stadtfeld M，Nagaya M，Utikal J，et al.Induced pluripotent stem cells generated without viral integration［J］.Science，2008，322(5903):945-949.

［12］Yu J，Hu K，Smuga-Otto K，et al.Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences［J］.Science，2009，32(5928):797-801.

［13］Carey BW，Markoulaki S，Hanna J，et al.Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106(1):157-162.

［14］Woltjen K，Michael IP，Mohseni P，et al.piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells［J］.Nature，2009，458(7239):766-770.

［15］Yusa K，Rad R，Takeda J，et al.Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon［J］.Nat Methods，2009，6(5):363-369.

［16］Huangfu D，Maehr R，Guo W，et al.Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds［J］.Nat Biotechnol，2008，26(7):795-797.

［17］Huangfu D，Osafune K，Maehr R，et al.Induction of pluripotent stem cells from primary human fibroblasts with only Oct4 and Sox2［J］.Nat Biotechnol，2008，26(11):1269-1275.

［18］Zhao Y，Yin X，Qin H，et al.Two supporting factors greatly improve the efficiency of human iPSC generation［J］.Cell Stem Cell，2008，3(5):475-479.

［19］Ichida JK，Blanchard J，Lam K，et al.A small-molecule inhibitor of tgf-Beta signaling replaces sox2 in reprogramming by inducing nanog［J］.Cell Stem Cell，2009，5(5):491-503.

［20］Wilson KD，Venkatasubrahmanyam S，Jia F，et al.MicroRNA profiling of human-induced pluripotent stem cells［J］.Stem Cells Dev，2009，18(5):749-758.

［21］Loh YH，Agarwal S，Park IH，et al.Generation of induced pluripo-tent stem cells from human blood［J］.Blood，2009，113(22):5476-5479.

［22］Aoi T，Yae K，Nakagawa M，et al.Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells［J］.Science，2008，321(5889):699-702.

［23］Kim JB，Sebastiano V，Wu G，et al.Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells［J］.Cell，2009，136(3):411-419.

［24］Stadtfeld M，Brennand K，Hochedlinger K.Reprogramming of pancreatic beta cells into induced pluripotent stem cells［J］.Curr Biol，2008，18(12):890-894.

［25］Kim JB，Greber B，Arauzo-Bravo MJ，et al.Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4［J］.Nature，2009，461(7264):649-643.

［26］Utikal J，Maherali N，Kulalert W，et al.Sox2 is dispensable for the reprogramming of melanocytes and melanoma cells into induced pluripotent stem cells［J］.J Cell Sci，2009，122(19):3502-3510.

［27］Giorgetti A，Montserrat N，Aasen T，et al.Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood using OCT4 and SOX2［J］.Cell Stem Cell，2009，5(4):353-357.

［28］Haase A，Olmer R，Schwanke K，et al.Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood［J］.Cell Stem Cell，2009，5(4):434-441.

［29］Eminli S，F(xiàn)oudi A，Stadtfeld M，et al.Differentiation stage determines potential of hematopoietic cells for reprogramming into induced pluripotent stem cells［J］.Nat Genet，2009，41(9):968-976.

［30］Miura K，Okada Y，Aoi T，et al.Variation in the safety of induced pluripotent stem cell lines［J］.Nat Biotechnol，2009，27(8):743-745.

［31］Greenbaum LE.From skin cells to hepatocytes:advances in application of iPS cell technology［J］.J Clin Invest，2010，120(9):3102-3105.

［32］Ye L，Chang JC，Lin C，et al.Induced pluripotent stem cells offer new approach to therapy in thalassemia and sickle cell anemia and option in prenatal diagnosis in genetic diseases［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106(24):9826-9830.

［33］Xie CQ，Huang H，Wei S，et al.A comparison of murine smooth muscle cells generated from embryonic versus induced pluripotent stem cells［J］.Stem Cells Dev，2009，18(5):741-748.

［34］Narazaki G，Uosaki H，Teranishi M，et al.Directed and systematic differentiation of cardiovascular cells from mouse induced pluripotent stem cells［J］.Circulation，2008，118(5):498-506.

［35］Mauritz C，Schwanke K，Reppel M，et al.Generation of functional murine cardiac myocytes from induced pluripotent stem cells［J］.Circulation，2008，118(5):507-517.

［36］Asai Y，Tada M，Otsuji TG，et al.Combination of functional cardiomyocytes derived from human stem cells and a highly-efficient microelectrode array system:an ideal hybrid model assay for drug development［J］.Curr Stem Cell Res Ther，2010，5(3):227-232.

［37］Dimos JT，Rodolfa KT，Niakan KK，et al.Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons［J］.Science，2008，321(5893):1218-1221.

［38］Amoh Y，Katsuoka K，Hoffman RM.The advantages of hair follicle pluripotent stem cells over embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells for regenerative medicine［J］.J Dermatol Sci，2010，60(3):131-137.