樹突狀細(xì)胞的研究進(jìn)展

馮鐘煦(綜述)，劉劍勇(審校)

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科，南寧530021)

樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)是目前人體內(nèi)最活躍，功能最強(qiáng)大的專職抗原呈遞細(xì)胞，是人體對(duì)免疫原產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞之一。DC廣泛存在于血液、淋巴、肝脾及皮膚黏膜等組織，能激活功能性淋巴細(xì)胞，并產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，提高機(jī)體免疫水平。DC對(duì)抗原和弱抗原都有很高的呈遞效率，只需少量的抗原及DC即可激活T細(xì)胞，因此成為抗腫瘤和抗病毒免疫研究中的熱點(diǎn)。

1 DC的來(lái)源與分化發(fā)育

DC的產(chǎn)生分兩個(gè)階段:從祖細(xì)胞分化為未成熟DC和未成熟DC受外界刺激(如細(xì)菌產(chǎn)物、壞死物及及各種細(xì)胞因子)分化成熟。

1.1 DC的分化 體內(nèi)DC起源于多能造血干細(xì)胞，按來(lái)源其分化途徑分為兩條:①髓系分化途徑。稱為髓系DC(myebiod，DC1)，最終分化為朗格漢斯細(xì)胞和間質(zhì)DC兩個(gè)亞群。DC1由髓樣干細(xì)胞在粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、腫瘤壞死因子α刺激下誘生為DC。亦有來(lái)源于外周血單核細(xì)胞，也稱為DC1前體細(xì)胞，在GM-CSF、白細(xì)胞介素4(interleukin-4，IL-4)作用下或穿越內(nèi)皮細(xì)胞并吞噬異物后分化為DC。②淋巴系分化途徑。為淋巴系DC(lymphoid，DC2)，最終分化為類漿細(xì)胞DC。DC2的前體細(xì)胞不表達(dá)髓系抗原，也無(wú)吞噬、吞飲抗原能力，低表達(dá)GM-CSF，高表達(dá) I L-3受體，在IL-3刺激下分化為DC2。目前對(duì)DC亞群及分化的研究主要來(lái)源于體外培養(yǎng)的方法，體內(nèi)天然DC亞群的分類仍有待于進(jìn)一步研究［1］。

1.2 DC的表型變化 DC的發(fā)育分為成熟與未成熟階段，兩者具有不同的生物學(xué)特征和細(xì)胞表型［2］。正常情況下，體內(nèi)多數(shù)DC處于未成熟階段，其廣泛分布于全身各外周組織，高表達(dá)吞噬相關(guān)受體(Fc受體、補(bǔ)體受體、甘露糖受體)，而不表達(dá)或低表達(dá)共刺激分子和黏附分子(CD14、CD54、CD40、CD80)。未成熟DC有較強(qiáng)的抗原內(nèi)吞和加工處理能力，而激發(fā)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)能力較弱。經(jīng)過(guò)抗原攝取、炎性因子活化等一系列過(guò)程，DC由未成熟轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒?，成熟DC則高表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ類分子和CD54、CD40、CD80、CD86等共刺激分子和黏附分子，CD83、CD25為成熟DC的特征性標(biāo)志。成熟DC的抗原呈遞能力及體外激發(fā)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的能力強(qiáng)，而抗原攝取能力弱。DC的成熟過(guò)程同時(shí)伴有遷徙，在外周組織中攝取抗原后，通過(guò)延長(zhǎng)樹突狀突起，改變趨化因子受體表達(dá)等方式進(jìn)入淋巴結(jié)及淋巴管中成熟，并激發(fā)T細(xì)胞反應(yīng)。

2 DC在免疫應(yīng)答中的作用

2.1 外源性抗原的攝取與加工 未成熟DC具有極強(qiáng)的內(nèi)吞能力，通過(guò)膜皺縮和形成大囊泡，形成液相內(nèi)吞作用，可使極低濃度(10～10 mol/L)抗原得到呈遞，也可通過(guò)受體介導(dǎo)對(duì)糖基化抗原進(jìn)行內(nèi)吞。被DC攝取的抗原分子經(jīng)過(guò)MHCⅡ類途徑處理、加工成為抗原多肽，再以MHCⅡ類分子/肽復(fù)合物形式呈遞在DC表面，并可以維持較長(zhǎng)時(shí)間(24～48 h)的免疫激發(fā)功能。未成熟DC對(duì)吞飲速度快，吞飲量大，是體內(nèi)抗原的主要攝取者［3］。

2.2 DC在免疫激活的作用 攝取抗原后的DC逐漸成熟并表現(xiàn)出很強(qiáng)的免疫激活能力。在與T細(xì)胞的互動(dòng)中，除提供MHCⅡ類分子/肽復(fù)合物的第一信號(hào)外，還高表達(dá)B7-1、B7-2、CD40分子，為T細(xì)胞提供充足第二信號(hào)，來(lái)促進(jìn)T細(xì)胞的激活。實(shí)驗(yàn)證明，DC還可參與B細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化與抗體生成。通過(guò)誘導(dǎo)T細(xì)胞生成B細(xì)胞刺激因子，作用于B細(xì)胞，使其分泌IgG、IgA、IgM［4］。

2.3 誘導(dǎo)自身免疫耐受 DC是體內(nèi)唯一能激活靜息型T細(xì)胞產(chǎn)生初次免疫應(yīng)答的細(xì)胞，并且能通過(guò)點(diǎn)狀放大刺激，激活T細(xì)胞增殖［5］。因此，在誘導(dǎo)T細(xì)胞活化或耐受過(guò)程中，DC發(fā)揮著十分重要的作用。未成熟DC誘導(dǎo)免疫激活的能力較弱。有學(xué)者推測(cè)，未成熟DC很可能在免疫耐受的產(chǎn)生中發(fā)揮了重要作用，目前無(wú)直接證據(jù)支持這一理論。有觀點(diǎn)認(rèn)為DC的不同成熟狀態(tài)有著不同的功能，DC的不同成熟狀態(tài)不僅決定T細(xì)胞的激活程度，而且決定T細(xì)胞的反應(yīng)類型［6］。存在于非淋巴組織中(如肝、腎、皮膚、血液等)的DC是一群未成熟DC，具有極強(qiáng)的攝取、處理和一定的呈遞抗原能力。由于缺乏B7等共刺激分子，不能活化T細(xì)胞，反而使T細(xì)胞功能失活，誘導(dǎo)T細(xì)胞耐受，被認(rèn)為是“耐受性DC”。

3 DC抗腫瘤免疫機(jī)制

人體的抗腫瘤免疫流程:①腫瘤相關(guān)抗原的攝取與呈遞;②激活腫瘤相關(guān)抗原特異性T細(xì)胞;③引導(dǎo)腫瘤相關(guān)抗原特異性T細(xì)胞至腫瘤部位，殺滅腫瘤細(xì)胞。機(jī)體抗腫瘤免疫主要依靠細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)的免疫應(yīng)答來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞，CTL并不能識(shí)別完整的腫瘤抗原分子，只能特異性地識(shí)別來(lái)源于腫瘤抗原親本、由MHC分子呈遞的抗原多肽。在大部分惡性腫瘤中，腫瘤細(xì)胞表面的MHC抗原肽、共刺激分子和黏附分子表達(dá)較低，不能有效地誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，故需要抗原呈遞細(xì)胞的協(xié)同作用［7-8］。

作為體內(nèi)抗原呈遞能力最強(qiáng)的專職抗原呈遞細(xì)胞，DC在抗腫瘤免疫中起到“中樞性”的作用，其作用的發(fā)揮依賴于以下環(huán)節(jié):DC浸潤(rùn)入腫瘤組織;DC對(duì)腫瘤抗原的攝取、加工和呈遞;DC的活化以及遷移進(jìn)入次級(jí)淋巴器官誘導(dǎo)T細(xì)胞活化。除誘導(dǎo)細(xì)胞免疫外，DC還可以增強(qiáng)體液免疫:一方面，DC通過(guò)促進(jìn)抗原特異性CD4+Th的產(chǎn)生，促進(jìn)抗體生成;另一方面，DC直接作用于B細(xì)胞，促進(jìn)免疫球蛋白的分泌。淋巴系DC中的類漿細(xì)胞可分泌Ⅰ型干擾素，直接誘導(dǎo)初始和記憶B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生大量免疫球蛋白IgM［9］。

DC可以通過(guò)與某些腫瘤細(xì)胞相互接觸，直接抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［10］。腫瘤抗原致敏的DC可釋放一種具有抗原呈遞能力的囊泡小體exosomes，該小體內(nèi)含有大量MHCⅠ、Ⅱ類分子和共刺激分子，能顯著刺激抗原特異性CD8+T細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)抗原特異性CTL反應(yīng)［11］。

研究表明，在腫瘤患者體內(nèi)，DC的數(shù)量下降，功能也受到了不同程度的抑制，不能有效攝取、處理、呈遞腫瘤抗原，使機(jī)體的免疫反應(yīng)處于抑制狀態(tài)，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。另外，DC浸潤(rùn)、遷移和活化的局部微環(huán)境的變化，導(dǎo)致DC不能進(jìn)入腫瘤組織，不能有效地識(shí)別腫瘤提供的“危險(xiǎn)”信號(hào)。DC遷出腫瘤組織困難，會(huì)抑制DC表型和功能的成熟進(jìn)程，從而抑制免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。腫瘤局部DC的數(shù)量和功能狀態(tài)與腫瘤進(jìn)展部的預(yù)后明顯相關(guān)［12］，因此通過(guò)人為方法保證DC的高效運(yùn)作成為腫瘤免疫治療的有效途徑。

4 DC的培養(yǎng)和DC疫苗的制備

正常人體內(nèi)DC數(shù)量少，不能滿足科研和臨床的需要。體外誘導(dǎo)培養(yǎng)DC技術(shù)的進(jìn)步使DC疫苗抗腫瘤治療成為可能。

4.1 DC的培養(yǎng) 目前用于治療的DC多來(lái)自骨髓或外周血CD34+造血祖細(xì)胞、外周血DC及單核細(xì)胞，其中以單核細(xì)胞來(lái)源的DC應(yīng)用最廣。獲取DC的方法有:①將來(lái)源于骨髓或外周血CD34+造血祖細(xì)胞在體外與GM-CSF和腫瘤壞死因子α共同培養(yǎng)，獲得大量DC［13］。②單核細(xì)胞在GM-CSF和IL-4共同作用下誘導(dǎo)分化為未成熟DC，并在外來(lái)因素刺激下進(jìn)一步分化為成熟DC［14］。③Flt3配體能動(dòng)員DC進(jìn)入外周血，顯著增加外周血中DC的數(shù)量，進(jìn)而直接從外周血中分離純化到大量DC［15］。

另外，有研究使用臍血來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞制備DC［16］，即用臍血單個(gè)核細(xì)胞，在GM-CSF、IL-4和臍血中的細(xì)胞因子作用下分化成未成熟DC。該實(shí)驗(yàn)用臍血漿取代腫瘤壞死因子α在較短時(shí)間內(nèi)促進(jìn)臍血單個(gè)核細(xì)胞分化成DC，充分利用臍血中富含的細(xì)胞因子，減少了重組細(xì)胞因子的用量，提供了一個(gè)由臍帶血制備DC的相對(duì)簡(jiǎn)單、高效的途徑。

4.2 腫瘤抗原負(fù)載DC的方法

4.2.1 多肽類抗原負(fù)載DC 用腫瘤已知的特異性多肽物質(zhì)作為抗原負(fù)載物，靶向性較好，可避免自身免疫反應(yīng)的發(fā)生，較安全。莊志祥等［17］用前列腺特異性抗原、前列腺特異性膜抗原與前列腺酸性磷酸酶多肽聯(lián)合致敏自體DC治療激素難治性前列腺癌，結(jié)果明顯改善了患者免疫功能，有效激發(fā)了特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答，病情得到控制和緩解。

4.2.2 腫瘤細(xì)胞成分負(fù)載DC 用完整腫瘤細(xì)胞作為抗原負(fù)載DC，不需要分離鑒定腫瘤抗原，且有多種抗原表位供識(shí)別。具體應(yīng)用可采用腫瘤細(xì)胞裂解物、凋亡的腫瘤細(xì)胞及腫瘤mRNA來(lái)負(fù)載，也有用電融合技術(shù)將DC與腫瘤細(xì)胞融合［18］。以上負(fù)載物各具特點(diǎn):①腫瘤細(xì)胞裂解物刺激DC，可有明顯的抗腫瘤效應(yīng)［19］，但需要腫瘤組織多，且抗原繁多不可控，有激發(fā)自身免疫性疾病的危險(xiǎn)。②凋亡的腫瘤細(xì)胞或凋亡的腫瘤抗原比腫瘤裂解物有更高的負(fù)載效率。李旭奎等［20］應(yīng)用SACC283癌細(xì)胞凋亡抗原體外沖擊致敏的方法負(fù)載DC，并成功在體外誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的抗腺樣囊性癌細(xì)胞的免疫反應(yīng)，證實(shí)了凋亡抗原負(fù)載DC的有效性。③腫瘤的mRNA可通過(guò)擴(kuò)增技術(shù)從有限的標(biāo)本得到足量的mRNA，同時(shí)可極大地避免自身抗原的混雜，防止自身免疫反應(yīng)的發(fā)生。也有直接用腫瘤細(xì)胞與DC融合，所得腫瘤疫苗不僅具有完整的腫瘤抗原，而且具有呈遞細(xì)胞的特性，能夠有效呈遞腫瘤抗原給T淋巴細(xì)胞，從而激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答。

4.2.3 抗原基因?qū)隓C 將腫瘤抗原的基因?qū)隓C，讓腫瘤抗原在DC內(nèi)表達(dá)，進(jìn)而有效激活T細(xì)胞。導(dǎo)入的方法主要是采用病毒載體，包括反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒等。有研究證實(shí)，攜帶目的基因的重組病毒轉(zhuǎn)染的DC疫苗誘導(dǎo)CTL能力高于抗原肽或全抗原負(fù)載的DC［21］。其原因可能為轉(zhuǎn)染后抗原的表達(dá)在DC內(nèi)部，內(nèi)源性抗原更有利于DC對(duì)抗原的加工。雖然病毒殼蛋白可作為免疫原刺激DC活化，導(dǎo)致病毒特異性免疫應(yīng)答產(chǎn)生，但病毒與宿主細(xì)胞有整合的危險(xiǎn)，該方法尚待完善。

4.2.4 細(xì)胞因子基因?qū)隓C DC的生長(zhǎng)需要多種細(xì)胞因子刺激完成。負(fù)載抗原刺激DC分泌的IL-2、IL-12、腫瘤壞死因子α等細(xì)胞因子可延長(zhǎng)DC及其誘導(dǎo)的CTL的壽命。向DC導(dǎo)入細(xì)胞因子或趨化因子的基因，可增強(qiáng)其抗腫瘤效應(yīng)。曹大勇等［22］以反復(fù)凍融的肝癌細(xì)胞沖擊致敏IL-2基因修飾的DC，誘導(dǎo)出較肝癌細(xì)胞致敏DC更高水平的CTL。

5 DC疫苗治療腫瘤的研究進(jìn)展與前景

從1996年首次報(bào)道DC疫苗應(yīng)用于臨床免疫治療到現(xiàn)在，DC疫苗已經(jīng)在惡性淋巴瘤、惡性黑素瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胃癌等惡性腫瘤的臨床治療中取得了較好的療效［22］。2002年DC疫苗作為腫瘤生物治療的方案通過(guò)美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)，正式進(jìn)入臨床試驗(yàn)，DC疫苗的研究也展現(xiàn)了極好的發(fā)展和臨床應(yīng)用前景。在我國(guó)肝癌發(fā)病率呈緩慢上升趨勢(shì)，病死率也隨之上升，占癌癥病死率的第三位，發(fā)展DC疫苗抗肝癌治療的研究具有較高的臨床價(jià)值。Palmer等［23］報(bào)道了 DC疫苗的Ⅱ期臨床試驗(yàn)，對(duì)35例不適合手術(shù)的晚期肝癌患者每間隔3周注射DC疫苗，其中25例患者至少接受3次注射后評(píng)估其臨床反應(yīng)。結(jié)果顯示，影像學(xué)控制率為28%，甲胎蛋白＞1000 μg/L的17例患者中有4例甲胎蛋白下降＞10%，證明了同源DC疫苗的安全性和有效性。肝癌屬于實(shí)質(zhì)性腫瘤，局部免疫治療在生存期、復(fù)發(fā)率和不良反應(yīng)等方面均好于系統(tǒng)免疫治療。DC瘤苗單獨(dú)治療使用很難取得理想的抗腫瘤效果，往往需要與手術(shù)、放療、化療的聯(lián)合應(yīng)用，而與免疫刺激劑聯(lián)合應(yīng)用也是常用方法。王志明等［24］采用腫瘤裂解抗原致敏的DC疫苗局部瘤內(nèi)注射聯(lián)合應(yīng)用非甲基化CpG-ODN，明顯抑制小鼠H22腫瘤的生長(zhǎng)，說(shuō)明DC疫苗對(duì)H22腫瘤有抑制作用，同時(shí)也顯示出聯(lián)合非甲基化CpG-ODN瘤內(nèi)注射可進(jìn)一步提高局部抗腫瘤生長(zhǎng)作用。

大多數(shù)研究均能夠檢測(cè)到由DC瘤苗所致的抗腫瘤免疫反應(yīng)，提示負(fù)載有腫瘤抗原的DC在體內(nèi)是能夠表達(dá)和增強(qiáng)腫瘤的免疫原性，進(jìn)而增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的抗腫瘤作用。當(dāng)然，要使DC腫瘤疫苗在臨床上廣泛應(yīng)用，還存在各種各樣的問(wèn)題，如制備的最優(yōu)方法以及接種的最佳程序還存在爭(zhēng)議;DC疫苗長(zhǎng)期作用中有可能會(huì)誘發(fā)機(jī)體的自身免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn);活化的T細(xì)胞不能完全滲透入腫瘤或不明原因的失活以及疫苗使用劑量、免疫頻率、療效評(píng)價(jià)等問(wèn)題有待于進(jìn)一步研究解決。相信隨著科研的深入及醫(yī)療技術(shù)的不斷完善，DC疫苗抗腫瘤治療會(huì)有更大的應(yīng)用前景。

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