燈盞花素對糖尿病大鼠腎皮質(zhì)糖基化終產(chǎn)物受體mRNA表達(dá)的影響

孫潔敏 馬曉蘭 沈建國 姚美芬 李璐璐 李 琦

隨著胰島素的廣泛應(yīng)用和各種口服抗糖尿病藥的發(fā)現(xiàn)，目前嚴(yán)重影響糖尿病患者生存質(zhì)量的主要原因是各種并發(fā)癥。其中糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是最為嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。近年來國內(nèi)外大量研究表明晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)及其受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)以及氧化應(yīng)激在DN的發(fā)生發(fā)展中起到了很大的作用［1］。燈盞花(erigeronbreviscapus，EB)又名燈盞細(xì)辛，為菊科植物短葶飛蓬的全草，為一種植物藥。目前的研究發(fā)現(xiàn)它能通過抑制氧化應(yīng)激和增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化作用來防治糖尿病腎?。?］。本實驗采用單次腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘發(fā)的大鼠糖尿病模型，用半定量反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT－PCR)方法觀察其腎皮質(zhì)RAGE mRNA的表達(dá)，旨在闡明燈盞花素對腎皮質(zhì)RAGE mRNA表達(dá)的影響，以表明其對糖尿病腎病的防治作用，為DN的防治提供實驗依據(jù)和新的方法。

材料與方法

1．材料:選用浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院動物實驗室培育的Sprague－Dawley(SD)雄性大鼠。主要試劑有燈盞花素片(上海雷允上藥業(yè)有限公司)，鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司。

2．方法:(1)動物模型的建立和分組 SD雄性大鼠27只，體重230～280g。隨機(jī)分為以下3組:正常對照組(C組)9只，糖尿病安慰劑組(D組)9只，糖尿病燈盞花素治療組(DD組)9只。飼養(yǎng)10天后禁食12h，D組和DD組予一次性腹腔注射65mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)，C組予一次性腹腔注射同等劑量的檸檬酸鈉緩沖液，72h后尾靜脈測血糖，以血糖 ＞16.7mmol/L確定為造模成功。其中DD組2只，D組1只血糖＜16．7mmol/L，3天后補(bǔ)注STZ(以15mg/kg體重劑量腹腔注射)，72h后測血糖＞16．7mmol/L。DD組每日給予燈盞花素混懸液［20mg/(kg·d)］灌胃。D組和C組每日給予同等劑量的生理鹽水灌胃。每隔2周稱體重測血糖1次。(2)RTPCR檢測腎皮質(zhì)中RAGE mRNA的表達(dá):①8周后，取腎皮質(zhì)100mg提取RNA;②用紫外分光光度計測定RNA;③反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;④PCR:分別進(jìn)行RAGE及β－actin擴(kuò)增;⑤PCR產(chǎn)物分析:取PCR產(chǎn)物5μl，上樣于瓊脂糖凝膠中，電泳至凝膠全長的2/3后，照相記錄。用G:BOX SYNGENE凝膠成像儀得電泳圖像。掃描特異性條帶的密度，取得光密度(optical density，OD)值。得出相對單位(相對單位=RAGE OD值/β－actin OD值)。

3．統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS 16．0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均行正態(tài)分布檢驗及方差齊性檢驗，正態(tài)分布數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，3組間比較用方差分析，兩組間比較采用t檢驗。p＜0．05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

3組大鼠成模時的體重?zé)o顯著性差異(P＞0.05);組間比較D組和DD組血糖同C組相比有顯著差異(p＜0．01)，DD組與D組間血糖無顯著性差異(P ＞0．05);而在成模2、4、6、8 周時，D 組和 DD 組與C組大鼠比較，體重、血糖均有顯著性差異(p＜0.01)，而D組和DD組之間體重、血糖無顯著性差異(P ＞0．05)(表1)。

表1 大鼠成模用藥后3組大鼠體重、血糖測定)

表1 大鼠成模用藥后3組大鼠體重、血糖測定)

與C組比較，*p＜0．01;D組老鼠有2只分別死于第5周及第7周

周數(shù) 組別 n 體重(g) 血糖(mmol/L)0 DD 9 297．86 ±42．95 27．77 ±3．46*D 9 295．44 ±13．11 30．23 ±3．06*C 9 302．00 ±14．37 5．62 ±0．24 2 DD 9 315．00 ±47．69* 31．11 ±4．03*D 9 285．11 ±14．72* 29．50 ±2．77*C 9 348．22 ±28．88 6．43 ±0．50 4 DD 9 310．86 ±49．10* 30．36 ±4．12*D 8 281．88 ±16．17* 32．20 ±2．59*C 9 388．89 ±36．78 5．95 ±0．42 6 DD 9 314．86 ±29．59* 31．65 ±1．46*D 8 298．84 ±23．04* 32．14 ±2．59*C 9 421．44 ±35．42 5．95 ±0．33 8 DD 9 291．00 ±30．19* 30．98 ±3．26*D 7 281．10 ±19．99* 31．30 ±1．52*C 9 453．31 ±50．53 6．28 ±0．40

實驗8周后，糖尿病大鼠腎皮質(zhì)內(nèi)RAGE表達(dá)較高與正常大鼠腎皮質(zhì)內(nèi)RAGE表達(dá)相比有顯著性差異(p＜0．01)。經(jīng)燈盞花素治療后(DD組)RAGE mRNA的表達(dá)水平與D組相比有明顯降低，具有顯著性差異(p＜0．01)(表2)。3組大鼠腎皮質(zhì)RTPCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳(圖1)。

表2 各組大鼠腎皮質(zhì)RAGE mRNA的表達(dá)

表2 各組大鼠腎皮質(zhì)RAGE mRNA的表達(dá)

與C組比較，*P ＜ 0．01;與D組比較，▲P ＜ 0．01

組別 n RAGE OD值/β－actin OD值DD 9 0．452 ±0．208＊▲D 70．769 ±0．104*0．218 ±0．032 C 9

圖1 糖尿病大鼠腎皮質(zhì)RT－PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳

討 論

在糖尿病病人中，持續(xù)性的高血糖及氧化應(yīng)激使得蛋白質(zhì)尤其是長效蛋白質(zhì)如皮膚膠原蛋白廣泛被共價修飾從而加速了AGE的形成［3］。AGEs可通過多種病理機(jī)制參與糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。而受體介導(dǎo)的途徑是AGEs造成糖尿病慢性并發(fā)癥和心血管疾病的主要機(jī)制。在幾種不同的AGEs特異性受體中，研究最多、作用最明確的是RAGE。研究證實糖尿病動物的腎臟中檢測出AGEs顯著增加，給予正常小鼠AGE白蛋白后可以形成與糖尿病腎病相同的腎臟病變，而給予AGE形成抑制劑如氨基胍或RAGE特異性中和抗體則可以減輕這些改變。因此對AGE－RAGE途徑的抑制已成為治療糖尿病腎病的一個重要靶點［4，5］。本實驗結(jié)果顯示糖尿病組大鼠腎皮質(zhì)中RAGE mRNA的表達(dá)比正常對照組明顯增高，具有顯著差異(p＜0．01)，這與國內(nèi)外大量研究報道一致，進(jìn)一步證實了糖尿病腎病的發(fā)生與RAGE所介導(dǎo)的組織損傷作用有關(guān)。

燈盞花素又名燈盞細(xì)辛，為菊科植物短葶飛蓬的全草，為一種植物藥，其有效成分為二咖啡?？鼘幩?，焦炔康酸，原二茶酸等黃酮類化合物［6］。燈盞花素除了其擴(kuò)張血管，降低血液黏度，增加血流量，改善局部供血，減少血小板計數(shù)及抑制血小板積聚等功能對DN的防治有作用外，目前的研究還發(fā)現(xiàn)它通過抑制氧化應(yīng)激和增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化作用來防治糖尿病腎病。本實驗結(jié)果也顯示糖尿病大鼠腎皮質(zhì)的RAGE mRNA表達(dá)明顯高于正常對照組(p＜0．01)，而用燈盞花素治療糖尿病大鼠8周后，與未治療的糖尿病大鼠相比RAGE mRNA的表達(dá)水平顯著降低(p＜0.01)。本實驗結(jié)果同時顯示燈盞花素對糖尿病大鼠的血糖無影響。所以燈盞花素降低RAGE在腎皮質(zhì)的表達(dá)作用是獨立于降糖作用以外的，可能與其抑制氧化應(yīng)激和增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化作用，以及抑制血NF－κB及 TGF－β水平增加有關(guān)，為防治糖尿病腎病提供了新的方法。

1 Suzuki D，Toyoda M，Yamamoto N，et al．Relationship between the expression of advanced glycation end－products(AGE)and the receptor for AGE(RAGE)mRNA in diabetic nephropathy［J］．Intern Med，2006，45(7):435－441

2 馬麗，朱邦豪，陳健文，等．燈盞花素對糖尿病大鼠腎臟氧化應(yīng)激的影響［J］．中國藥理學(xué)通報，2004，20(9):1030－1033

3 Jian GS，Mei FY，Xiao CC，et al．Effects of puerarin on receptor for advanced glycation end products in nephridial tissue of streptozotocininduced diabetic rats［J］．Mol Biol Rep，2009，36(8):2229 －2233

4 Flyvbjerg A，Denner L，Schrijvers BF，et al．Long－term renal effects of a neutralizing RAGE antibody in obese type 2 diabetic mice［J］．Diabetes，2004，53:166－172

5 Chuang PY，Yu Q，F(xiàn)ang W，et al．Advanced glycation endproducts induce podocyte apoptosis by activation of the FOXO4 transcription factor［J］．Kidney Int，2007，72(8):965 －976

6 Wang M，Xie C，Cai RL，et al．Studies on antioxidant activities of breviscapine in the cell－ free system［J］．Am JChin Med，2008，36(6):1199－1207