磷酸二酯酶4D基因多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成性腦卒中的關(guān)系

王漢旻 陳曉麗 葉好好 畢 涌 潘東波 徐麗英 吳建波 黃海波

目前腦卒中已成為我國(guó)首位的致殘和死亡原因，其中約70%為缺血性腦卒中。缺血性卒中是環(huán)境和遺傳因素共同導(dǎo)致的復(fù)雜疾病。冰島deCODE研究組發(fā)現(xiàn)，在冰島人群中磷酸二酯酶4D(phosphodiesterase 4D，PDE4D)基因是大動(dòng)脈和心源性缺血性卒中的一種新的危險(xiǎn)因素，如能在其他人種中證實(shí)這個(gè)結(jié)論，將有助于卒中預(yù)防和治療［1］。之后在不同的種族，進(jìn)行了很多相關(guān)研究，但結(jié)果很不一致［2～6］。為驗(yàn)證PDE4D基因與缺血性卒中相關(guān)性，筆者選擇冰島deCODE研究組結(jié)果中PDE4D基因與卒中關(guān)系最強(qiáng)的2個(gè)位點(diǎn)，即SNP83、32;研究浙南地區(qū)漢族人群中PDE4D基因與動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成性腦卒中(atherothrombosis ischemic stroke，AIS)的關(guān)系。

對(duì)象與方法

1．研究對(duì)象:(1)病例組:收集2006年4月～2009年6月期間在溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院腦血管科或神經(jīng)內(nèi)科病房住院的AIS患者235例(其中男性148例，女性87例)。患者年齡41～90歲，平均年齡61．31±10．11歲。(2)無(wú)卒中病史的對(duì)照組:系同期來(lái)筆者醫(yī)院體檢者，共105例(其中男性60例、女性45例)，均行神經(jīng)查體、頭顱MRI/A及血管超聲檢查，排除既往卒中、TIA、血管狹窄。年齡41～84歲，平均年齡60．04±9．41歲。兩組均為浙南地區(qū)漢族人，無(wú)血緣關(guān)系，無(wú)遷移家史。兩組研究人群的臨床資料見(jiàn)表1。(3)入選標(biāo)準(zhǔn):①腦血管檢查(DSA/CTA/MRA/血管超聲)證實(shí)顱內(nèi)外動(dòng)脈存在狹窄≥50%或閉塞;②有與病變側(cè)血管供血區(qū)明確相關(guān)的臨床癥狀和體征;③發(fā)病后DWI證實(shí)存在病變側(cè)血管供血區(qū)新發(fā)生的腦梗死;④患者存在腦血管動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素。(4)排除標(biāo)準(zhǔn):①存在心源性栓子來(lái)源，如心臟瓣膜病變、心律失常、急性心肌梗死等;②其他非動(dòng)脈粥樣硬化性頸動(dòng)脈病變，如頸動(dòng)脈夾層、血管炎等;③存在其他可能導(dǎo)致腦梗死的因素，如紅細(xì)胞增多征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等。

2．血標(biāo)本生化檢測(cè)和臨床資料收集:抽取空腹血標(biāo)本，在筆者醫(yī)院檢驗(yàn)科利用自動(dòng)生化儀，常規(guī)檢測(cè)血脂、血糖、血電解質(zhì)、肝腎功能等項(xiàng)目。并且詳細(xì)詢問(wèn)病史，包括高血壓、糖尿病、煙酒史等。按照WHO標(biāo)準(zhǔn)，SBP＞140mmHg和(或)DBP＞90mmHg診斷為高血壓。

3．實(shí)驗(yàn)方法:采用DNA fast2000試劑盒(上海博邁生物技術(shù)有限公司)從全血中抽提基因組DNA。SNP32位點(diǎn)序列上游引物:5'－GCTAAATGATGAGTTAATGG－3'，下游引物:5'－CATAGCAAGAACCTGACC－3'。SNP83位點(diǎn)序列上游引物:上游引物:5'－TTGTTTCTAGTGTTAGCCTTG －3'，下游引物:5'－ATTTGGCCTTGCAATATAC－3'。以 200ngDNA為模板，在25μl體系內(nèi)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增(AB1．9700PCR儀)。先95℃變性2min，然后進(jìn)入循環(huán)，循環(huán)條件是 94℃ 30s，62．5℃30s，72℃ 30s，一共進(jìn)行43個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后，72℃延伸反應(yīng)5min。取擴(kuò)增產(chǎn)物5μl于15μl酶切反應(yīng)體系中進(jìn)行酶切，內(nèi)切酶分別為Msp AⅡ和MaeⅡ(分別購(gòu)自NEB、Fermentas公司)。經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠圖像分析系統(tǒng)下分析基因型。SNP32缺乏相應(yīng)酶切位點(diǎn)為A型(305bp 1條帶)，存在相應(yīng)酶切位點(diǎn)為G型(96bp、209bp，2條帶);SNP83缺乏相應(yīng)酶切位點(diǎn)為T型(492bp，1條帶)，存在相應(yīng)酶切位點(diǎn)為C型(288bp、204bp，2 條帶)。

4．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均由SPSS16．0統(tǒng)計(jì)軟件包完成。等位基因計(jì)數(shù)采用直接計(jì)數(shù)法，并計(jì)算基因型頻率?；蛐皖l率的分布經(jīng)Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn)，當(dāng)P＞0．05時(shí)，說(shuō)明群體基因遺傳平衡，數(shù)據(jù)來(lái)自同一蒙德?tīng)柸后w。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，病例組與對(duì)照組間不同基因型及等位基因分布頻率比較采用χ2檢驗(yàn)，多因素分析采用Logistic回歸。以p＜0．05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

1．病例組和對(duì)照組臨床資料的比較:病例組和對(duì)照組在年齡、性別、高血壓、吸煙、飲酒、TC、LDL－C、TG等方面無(wú)明顯差異;病例組糖尿病患者比例明顯高于對(duì)照組(p＜0．01);且病例組HDL－C明顯低于對(duì)照組(P ＜0．01)，詳見(jiàn)表1。

2．PDE4D基因SNP83在兩組中頻率分布:電泳圖片見(jiàn)圖1。PDE4D基因SNP83在病例組和對(duì)照組中的分布均符合Hardy－Weinberg定律。病例組C等位基因頻率(24．26%)高于對(duì)照組(15.71%)(P=0.012;OR=1．718;95%CI:1．120 ～2．633)詳見(jiàn)表2。3種不同基因型之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P=0．044;進(jìn)一步利用優(yōu)勢(shì)模型分析，病例組CC+CT基因型明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，(OR=1．875;95%CI:1．137 ～3．092);調(diào)整糖尿病、HDL－C等危險(xiǎn)因素后，差異仍存在(OR=2．023;95%CI:1．207 ～3．391)。

圖1 PDE4D基因SNP83多態(tài)性PCR－RFLP結(jié)果

表2 SNP83位點(diǎn)基因型和等位基因在兩組中的分布頻率及與卒中相關(guān)性［n(%)］

3．PDE4D基因SNP32在兩組中頻率分布:電泳圖片見(jiàn)圖2。PDE4D基因SNP32在兩組中的分布均符合Hardy－Weinberg定律。SNP32等位基因頻率在兩組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，詳見(jiàn)表3。

圖2 PDE4D基因SNP32多態(tài)性PCR－RFLP結(jié)果

表3 PDE4D基因SNP32在兩組中頻率分布［n(%)］

討 論

本研究結(jié)果表明病例組PDE4D基因SNP83C等位基因頻率明顯高于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明C等位基因?yàn)锳IS的致病風(fēng)險(xiǎn)基因;進(jìn)一步利用優(yōu)勢(shì)模型分析，病例組CC+CT基因型明顯高于對(duì)照組，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CC或CT基因型發(fā)病概率為TT型的2倍;結(jié)果提示SNP83是AIS的遺傳危險(xiǎn)因素。我們的結(jié)果與deCODE研究組結(jié)論一致［1］。在巴基斯坦人、澳大利亞人群中，也同樣發(fā)現(xiàn)SNP83與缺血性卒中相關(guān)［7，8］。Sun 等［9～11］人分別在中國(guó)不同地區(qū)漢族人群中證實(shí)了SNP83是缺血性卒中，尤其是AIS的遺傳危險(xiǎn)因子。然而在日本人群中卻未發(fā)現(xiàn)這種相關(guān)性，這可能與研究群體差異及缺血性卒中本身是多因素疾病等有關(guān)［5］。我們的研究結(jié)論同中國(guó)幾位學(xué)者結(jié)果完全一致，更加支持PDE4D(SNP83)基因是中國(guó)漢族人群AIS的致病基因。但本研究未發(fā)現(xiàn)SNP32與卒中的相關(guān)性，這同Brophy等［2，7］人研究結(jié)果一致，提示SNP32位點(diǎn)可能僅在冰島特定人群中與卒中有關(guān)。

PDE4D基因位于人類染色體5q12上，全長(zhǎng)約1.6Mb，含有24個(gè)外顯子。該基因的蛋白產(chǎn)物有9種異構(gòu)體。PDE4D在體內(nèi)廣泛表達(dá)，分布于各種炎性細(xì)胞內(nèi)，包括肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等［12］;同時(shí)在血管及神經(jīng)元中亦有表達(dá)。PDE4D基因編碼的PDE4D能特異性水解細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)，cAMP濃度主要由PDE4D的活性決定。在動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中，cAMP起著關(guān)鍵作用，它具有多種生物學(xué)作用，參與調(diào)控哺乳類動(dòng)物的血小板聚集、血管細(xì)胞的增殖和移行、免疫反應(yīng)等。體外和在體試驗(yàn)均證實(shí)，高濃度的cAMP可抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和移行;抑制炎癥反應(yīng)和血小板活化，減輕動(dòng)脈粥樣硬化程度。推測(cè)PDE4D通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)cAMP水平參與動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程，進(jìn)而影響卒中的發(fā)生。

頸動(dòng)脈中內(nèi)膜增厚和斑塊代表動(dòng)脈粥樣硬化不同病程，能獨(dú)立預(yù)測(cè)血管事件的發(fā)生［13］。英國(guó)有項(xiàng)研究表明PDE4D基因與頸動(dòng)脈中內(nèi)膜厚度和斑塊無(wú)相關(guān)性，提示該基因不是通過(guò)動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制發(fā)揮作用［6］。然而，臺(tái)灣學(xué)者發(fā)現(xiàn)對(duì)于男性患者，PDE4D基因與頸總動(dòng)脈動(dòng)脈中內(nèi)膜厚度及斑塊相關(guān)，而且進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)該基因?qū)Π邏K的影響遠(yuǎn)甚于中內(nèi)膜厚度，表明該基因參與動(dòng)脈粥樣硬化的形成。雖然臨床證據(jù)關(guān)于PDE4D基因與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系結(jié)果不甚一致，但基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)抑制PDE4D基因表達(dá)，可以阻止鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，支持PDE4D基因是致動(dòng)脈粥樣硬化因素。臨床研究的結(jié)果不一致可能與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)差別、樣本量小、不同人種等因素有關(guān)。

PDE4D在神經(jīng)元中含量也和血管中一樣豐富［18］。有研究報(bào)道cAMP，PDE4D的作用底物，在神經(jīng)元存活和神經(jīng)發(fā)生中具有一定作用。PDE4D敲除鼠和特異性PDE4D抑制劑，均可通過(guò)升高cAMP含量，增強(qiáng)記憶力、促進(jìn)海馬區(qū)神經(jīng)發(fā)生。這些研究表明PDE4D基因可能還有神經(jīng)元保護(hù)機(jī)制。

總之，本研究為PDE4D基因SNP83是中國(guó)漢族人群AIS的一個(gè)危險(xiǎn)基因提供了新證據(jù)。目前實(shí)驗(yàn)證據(jù)雖不太一致，但學(xué)者們普遍認(rèn)為PDE4D基因既參與動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程，又具有神經(jīng)保護(hù)作用。未來(lái)尚需進(jìn)一步研究該基因與卒中相關(guān)的確切機(jī)制，及將基因篩查應(yīng)用于臨床實(shí)踐和發(fā)展有效的神經(jīng)保護(hù)劑，以便能檢出高危人群，有利于卒中的預(yù)防和治療。

1 Gretarsdottir S，Thorleifsson G，Reynisdottir ST．et al．The gene encoding phosphodiesterase 4D confers risk of ischemic stroke［J］．Nat Genet，2003，35(2):131 －138

2 Brophy VH，Ro SK，Rhees BK，et al．Association of phosphodiesterase4D polymorphisms with ischemic stroke in a USpopulation strati?ed by hypertension status［J］．Stroke，2006，37(6):1385 － 1390

3 Meschia JF，Brott TG，Brown RD Jr，et al．Phosphodiesterase 4D and 5 － lipoxygenase activating protein in ischemic stroke［J］．Ann．Neurol，2005，58(3):351 －361

4 Nilsson －Ardnor S，Wiklund PG，Lindgren P，et al．Linkage of ischemic stroke to the PDE4D region on 5q in a Swedish population［J］．Stroke，2005，36(8):1666－1671

5 Nakayama T，Asai S，Sato N，et al．Genotype and haplotype association study of the strk1 region on 5q12 among Japanese:a case－control study［J］．Stroke，2006，37(1):69 － 76

6 Bevan S，Porteous L，Sitzer M，et al．Phosphodiesterase4D gene，ischemic stroke，and asymptomatic carotid atherosclerosis［J］．Stroke，2005，36(5):949 －953

7 Saleheen D，Bukhari S，Haider SR，et al．Association of phosphodiesterase4D gene with ischemic stroke in a pakistani population［J］．Stroke，2005，36(10):2270 －2277

8 Staton JM，Sayer MS，Hankey GJ，et al．Association between phosphodiesterase 4D gene and ischaemic stroke［J］．J Neurol Neurosurg Psychiatry，2006，77(9):1067 －1069

9 Sun Y，Huang Y，Chen X，et al．Association between the PDE4D gene and ischaemic stroke in the Chinese Han population［J］．Clinical Science，2009，117(7):265 －272

10 Xue H，Wang H，Song X，et al．Phosphodiesterase4Dgene polymorphism is associated with ischaemic and haemorrhagic stroke［J］．Clinical Science，2009，116(4):335 －340

11 Li N，He Z，Xu J，et al．Association of PDE4D and IL－1 gene polymorphism with ischemic stroke in a Han Chinese population［J］．Brain Res Bull 81，2010，81(1):38 －42

12 Landells LJ，Szilaqy CM，Jones NA，et al．Identication and quantification of phosphodiesterase 4 subtypes in CD4 and CD8 lymphocytes from healthy and asthmatic subjects［J］．Br J Pharmacol，2001，133(5):722－729

13 Lorenz MW，Markus HS，Bots ML，et al．Prediction of clinical cardiovascular events with carotid intima－media thickness:a systematic review and meta － analysis［J］．Circulation，2007，115(4):459 －467