2例EV71死亡病例的病理特征及EV71寧波分離株全基因組序列分析

方仲年 胡愛榮 張岳燦 顧文珍 蔣素文 胡耀仁 陸傳統(tǒng) 朱德東

手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)是一種主要由柯薩奇病毒A16(coxsakie virus A16，CV Al6)和腸道病毒71(enterovirus71，EV71)等引發(fā)的傳染病，臨床上以發(fā)熱和手、足、口部出現(xiàn)皮疹、皰疹等為主要特征。該病是一種自限性疾病，絕大多數(shù)病例1周內(nèi)可以痊愈，但少數(shù)患者可并發(fā)無菌性腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻痹、呼吸道感染和心肌炎等，如不及時治療，可能致命［1］。為了加強對本病的重視和認識，現(xiàn)將2例HFMD死亡患兒的臨床特點、尸體解剖結(jié)果及病原學檢測結(jié)果報告如下。

資料與方法

1．臨床資料:(1)病例1:男患兒，15個月，本地戶籍。發(fā)熱2天，流涎、手部皮疹1天。患兒于2010年7月16日出現(xiàn)發(fā)熱(體溫最高39℃)，食欲不振，無咳嗽。在當?shù)蒯t(yī)院予以輸液治療(具體用藥不詳)，第2天體溫恢復至正常。繼而出現(xiàn)流涎，左手指間出現(xiàn)小水皰疹，夜間有哭鬧。晨起煩躁不安，惡心、嘔吐4次。于2010年7月17日下午2時來寧波市第二醫(yī)院就診。查體:神志清楚，精神疲軟，上唇內(nèi)側(cè)黏膜處1處潰瘍，頸項不抵抗，心肺聽診無異常，生理反射存在，病理反射無異常，左手指間有小水皰疹。查血常規(guī):WBC 9．5×109/L，中性粒細胞 66．4%，淋巴細胞 23．5%，RBC 3．61 ×1012/L，Hb 96g/L，PLT 113×109/L。門診建議住院治療，但是患兒家屬拒絕住院。門診醫(yī)生予以“清開靈顆粒、抗病毒口服液、康復新液以及頭孢克肟”治療?；純河?010年7月17日夜間8時許病情惡化，出現(xiàn)呼吸困難，急送當?shù)蒯t(yī)院，但患兒已經(jīng)死亡。(2)病例2:男患兒，14個月，外來人口(貴州籍)。發(fā)熱，頭頸部及軀干紅色皮疹2天。發(fā)熱體溫最高39．1℃，無咳嗽、惡心、嘔吐及腹瀉。于2010年5月6～9日在當?shù)蒯t(yī)院門診就診。臨床懷疑為“手足口病”，并在門診輸液治療(具體用藥不詳)，未在醫(yī)院留觀。于2010年5月10日下午4時30分患兒突然無心跳、呼吸，急送上級醫(yī)院，但患兒已經(jīng)死亡。

2．尸體解剖及組織病理學:患兒均于第2天下午依法在寧波天一職業(yè)技術(shù)學院尸檢室進行尸體解剖，尸檢標本經(jīng)中性甲醛固定，石蠟包埋，4μm厚切片，HE染色，進行常規(guī)組織病理學觀察。并取患兒腸內(nèi)容物及腸道組織送寧波市疾病預防控制中心(CDC)進行病毒檢測，經(jīng)real－time PCR檢測均為EV71感染。

3．EV71的提取與擴增:患兒腸道內(nèi)容物經(jīng)超聲破碎離心后，應用Qiagen試劑盒(美國)提取病毒RNA，隨后進行反轉(zhuǎn)錄擴增得到cDNA(一步法RT－PCR試劑盒，日本TaKaRa公司，嚴格按照說明書操作)，擴增引物及片段長度見表1。反應條件為 94℃ 4min，隨后94℃ 45s，58℃ 45s，72℃ 2min，共計34個循環(huán)，72℃ 10min。3'末端快速擴增(3'RACE)及5'末端快速擴增(5'RACE)采用日本TaKaRa公司5'－and 3'－Full RACE試劑盒，嚴格按照說明書操作，擴增引物及片段長度見表1。反應條件為 94℃ 3min，隨后 94℃ 45s，55℃ 45s，72℃1min，共計25個循環(huán)，72℃ 10min。PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠上樣孔，另設(shè)空白對照和DNA標志物，直流80V電泳45min，紫外檢測儀下觀察結(jié)果并用凝膠成像系統(tǒng)保存。

表1 PCR引物、位置及目的片段

4．分子克隆、測序及同源性比較:PCR產(chǎn)物的純化DNA回收后，制備感受態(tài)細胞，將PCR產(chǎn)物連接入pMD18－T載體，按照載體說明書進行操作，挑選克隆經(jīng)過酶切鑒定后，終止法測定插入片段的核苷酸序列。采用DNAMAN軟件和Blast software(http://blast．ncbi．nlm．nih．gov/)對系列進行拼接和比對。

結(jié) 果

1．大體解剖所見:2例患兒均發(fā)育營養(yǎng)良好。手部有小泡疹，口腔黏膜小潰瘍，角膜混濁。額部、下頜、上頸、肩胛、上胸部及會陰、臀部均可見粉紅色丘疹，上唇及下唇均見口腔潰瘍。體表淋巴結(jié)未腫大?？诖健⒅讣装l(fā)紺。氣管內(nèi)見泡沫狀物質(zhì);氣胸試驗陰性，胸腔內(nèi)無明顯滲出液，兩肺組織體積增大，顯著暗紅色，質(zhì)地實，放入水中下沉;肺外膜、縱隔見少量出血點。心臟外觀正常，心包腔內(nèi)少量淡黃色液體滲出。腹腔內(nèi)無滲出液，腸系膜充血，部分空腸及回腸壞死呈灰褐色，腸系膜淋巴結(jié)腫大;腹腔其余器官未見明顯異常。顱腔內(nèi)無出血，顱內(nèi)少量淡紅色液體，腦膜充血，腦水腫顯著。

2．心臟鏡下所見:2例患兒心肌纖維細胞結(jié)構(gòu)正常，心肌間質(zhì)充血，心肌細胞水腫，心外膜少量炎性細胞浸潤。心臟結(jié)構(gòu)正常(圖1)。

圖1 心肌細胞水腫(HE，×200)

3．肺臟鏡下所見:2例患兒兩肺顯著充血，肺泡壁毛細血管和肺小靜脈高度擴張淤血，肺泡腔內(nèi)充滿水腫液，部分區(qū)域肺出血，使肺組織顯著實變，肺間質(zhì)及小血管周圍見少量炎細胞浸潤，以淋巴細胞為主(圖2、圖3)。病例2除上述表現(xiàn)外，兩肺散在區(qū)域性炎性細胞浸潤，以中性粒細胞及淋巴細胞為主。

4．腸道鏡下所見:2例患兒腸黏膜充血，腸黏膜下淋巴濾泡增生，空腸及回腸部分區(qū)域腸黏膜、黏膜下層、平滑肌層、漿膜均壞死，細胞核消失，胞質(zhì)及間質(zhì)溶解，腸壁變得菲薄。腸系膜淋巴結(jié)腫大，淋巴濾泡反應性增生，生發(fā)中心壞死(圖4、圖5)。

5．大腦鏡下所見:2例患兒大腦膜血管高度擴張充血，間質(zhì)水腫，軟腦膜及蛛網(wǎng)膜下腔炎性細胞浸潤，以淋巴細胞、巨噬細胞為主，病變累及大腦、顱底、小腦、脊髓等腦脊膜。脊髓、延腦、腦橋等腦干部位的實質(zhì)血管擴張、充血，血管間隙增寬，淋巴細胞、巨噬細胞等炎性細胞圍繞血管壁周圍浸潤，腦實質(zhì)散在片狀壞死，中性粒細胞浸潤，軟化灶形成(圖6～圖8)。

圖6 腦膜炎(腦膜炎性細胞浸潤)(HE，×200)

6．其他臟器鏡下所見:2例患兒肝血竇及中央靜脈淤血，肝細胞高度水腫，肝小葉結(jié)構(gòu)正常;腎間質(zhì)充血，腎小管上皮細胞水腫，腎近曲小管上皮細胞自溶;腎上腺髓質(zhì)充血;脾竇顯著淤血;胰腺組織結(jié)構(gòu)及胰腺細胞未見明顯異常;胸腺結(jié)構(gòu)正常，胸腺細胞增生，胸腺間質(zhì)充血。

7．病原學檢測:腸內(nèi)容物及總腸道組織病毒檢測(PCR)均為EV 71陽性(Ct值分別為19及17)。EV 71寧波分離株的全基因長度為7414個堿基，為C4亞型，命名為NBChina01，在GenBank的注冊登記號為 HQ828086。通過 ncbi nucleotide blast(http://blast．ncbi．nlm．nih．gov/)系統(tǒng)并與 GeneBank 中EV71其他的序列(EU812515．1)進行比較，同源性為98%［2］。

討 論

此2例患兒年齡均＜3歲，以發(fā)熱開始，但體溫恢復快，外周血白細胞計數(shù)增高不明顯，導致臨床醫(yī)師及患兒家屬輕視;然而該患兒精神較疲軟，夜間有哭鬧，煩躁不安，伴惡心、嘔吐。符合《手足口病診療指南(2010年版)》重癥病例早期識別的標準［3］。

EV71感染主要病理改變在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肺以及腸道。以顯著腦水腫為主要大體改變。文獻報道EV71感染的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變以病毒性腦干腦炎為主要病理學特點，表現(xiàn)為以淋巴單核細胞為主的炎性細胞圍繞腦血管形成血管軸套、神經(jīng)元壞死及軟化灶形成、小膠質(zhì)細胞增生并吞噬神經(jīng)元、形成膠質(zhì)結(jié)節(jié)等［4］。但該患兒除上述表現(xiàn)外，腦膜炎亦比較突出，軟腦膜及蛛網(wǎng)膜下腔炎性細胞浸潤，以淋巴細胞、巨噬細胞為主，病變累及大腦、顱底、小腦、脊髓等腦脊膜。因此，EV71重癥感染患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變應包括腦膜炎及腦炎。

肺臟亦是明顯受損的器官，兩肺充血及出血顯著，伴有肺間質(zhì)及小血管周圍炎細胞浸潤，與文獻報道一致［5］。眾多研究也證明EV71引起的肺部的病變是神經(jīng)源性的而非由病毒直接侵犯造成的，可能是基于肺組織病毒學檢測陰性，無彌漫性肺損傷及炎性浸潤的原因［6～8］。但本患兒肺間質(zhì)及小血管周圍均見以淋巴細胞為主的炎細胞浸潤，是否能作為病毒侵犯的間接依據(jù)?遺憾的是，本研究未對患兒的肺組織進行病毒學檢測。

關(guān)于EV71重癥患者腸道改變的報道較少。本患兒的腸道病變顯著，且腸內(nèi)容物及總腸道組織EV71病毒核酸檢測均為陽性，與韋丹及楊郁等［5，8］報道不一致。因此，對于重癥HFMD患兒，除密切關(guān)注神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)及循環(huán)系統(tǒng)表現(xiàn)外，腸道功能的保護亦不容忽視。

目前關(guān)于HFMD導致循環(huán)系統(tǒng)損害的機制觀點尚不一致，有認為是心肌損害或心肌炎所致;也有觀點認為其表現(xiàn)為神經(jīng)源性，是腦干腦炎引起的中樞性交感興奮所致，而非心源性［9］。依據(jù)本患兒的病理改變，作者認為以神經(jīng)源性損害為主，同時存在心肌損害及心包膜炎癥?；純浩渌K器亦有不同程度的損害及改變，但其器官組織的結(jié)構(gòu)基本正常，考慮為重癥病例組織器官充血、淤血引起的繼發(fā)性改變。

根據(jù)VP1區(qū)核苷酸序列，可將EV 71分為A、B、C 3個基因型，其中B型和C型又進一步分為B1～B5和C1～C5亞型，EV71寧波分離株為C4亞型，與其他的報道一致［3，10］。有研究認為，感染某些基因亞型EV71是導致重癥HFMD的因素之一，而中國內(nèi)地HFMD 重癥患兒主要為 C4 亞型 EV7l感染［3，11］。筆者認為，HFMD患兒嚴重的腸道損害可能與C4亞型EV71感染相關(guān)。

總之，EV71感染的HFMD病情進展快，中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肺臟以及腸道為主要受損臟器，嚴重的腦膜炎、腦干腦炎和神經(jīng)源性肺水腫、肺出血是死亡主要原因，除密切關(guān)注神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)及循環(huán)系統(tǒng)表現(xiàn)外，腸道功能的保護亦需要重視。2011年4～5月全國共上報HFMD病例330279例，死亡116例，發(fā)病率和病死率均居丙類傳染病的首位［12，13］。因此，臨床醫(yī)生特別是門急診醫(yī)生應該高度重視HFMD患兒的早期診斷和治療，尤其是那些癥狀不典型的嬰幼兒;同時，積極開展對EV71的全基因序列分析研究，可為闡明EV71的起源、致病機制及疫苗的研制提供線索。

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13 中國疾病預防控制中心公共衛(wèi)生監(jiān)測和信息服務中心．2011年5月中國甲乙丙類傳染病疫情動態(tài)簡介［J］．疾病監(jiān)測，2011，26(5):421