基于譜效相關(guān)的生地黃多指標(biāo)成分定量分析方法的研究

王 梅 郭東艷 師延瓊 王 幸

生地黃具有清熱涼血、養(yǎng)陰生津之功效，主要用于治療血熱出血證，現(xiàn)代臨床用以治療原發(fā)性血小板減少性紫癜、功能性子宮出血等疾?。?，2］。為控制生地黃藥材的質(zhì)量，筆者采用高效液相色譜法建立了生地黃止血作用的指紋圖譜，以梓醇為對(duì)照品，對(duì)達(dá)到基線分離的色譜峰進(jìn)行定量，計(jì)算出各指紋峰相對(duì)于梓醇的含量，并以其總量控制藥材的質(zhì)量。

材料與方法

1．材料與儀器:Waters2695高效液相色譜儀，Empower色譜工作站，2996二級(jí)管陣列檢測(cè)器;SB3200DT超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份公司);梅特勒電子天平(萬分之一);KZW－G型儀表恒溫不銹鋼水浴鍋(上海)。UV－1102型可見—紫外分光光度儀(上海天美科學(xué)儀器有限公司)。甲醇、乙腈均為色譜純，水為純凈水，其他試劑均為分析純。梓醇對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用，批號(hào)110808－200407)。生地黃購(gòu)自西安盛興中藥飲片有限責(zé)任公司(批號(hào)分別為 20100810、20101018、20101209)，經(jīng)陜西中醫(yī)學(xué)院生藥教研室王繼濤老師鑒定為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosa Libosch．的干燥塊根。

2．方法:(1)止血作用指紋圖譜的建立:色譜柱:Akasil－C18 柱(250．0mm ×4．6mm，5μm)，流動(dòng)相:乙腈(A)－ 水(B)梯度洗脫，0～5minA 由0．3%升至 1．0%，5 ～10min 1．0%升至2．6%，10 ～16min 2．6%，16 ～32minA 由2．6%升至 8．0%，32～40minA由8%升至15%，40～65minA由15%升至30%;檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm;柱溫:30℃;流速:1ml/min。指紋圖譜見圖1［3］。(2)指紋峰的標(biāo)定:根據(jù)圖1，對(duì)達(dá)到基線分離的色譜峰進(jìn)行標(biāo)定，確定為含量測(cè)定的對(duì)象。(3)對(duì)照品溶液的制備:取梓醇對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相溶解成每1ml含0．13mg的溶液，即得。(4)供試品溶液的制備:精密稱取生地黃粉末約1g，加入流動(dòng)相20ml超聲提取，濾過，取濾液蒸干，殘?jiān)昧鲃?dòng)相定容于5ml量瓶中，以微孔濾膜(0．45μm)濾過，即得。(5)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:分別精密吸取梓醇對(duì)照品溶液(濃度為 0．13mg/ml)1、5、10、15、20μl，按上述色譜條件注入色譜儀，以峰面積A為縱坐標(biāo)，梓醇含量C(μg)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為 A=270000．0000C+14585．0000，相關(guān)系數(shù) r=0．9999，梓醇在 0．13 ～2．60μg呈良好的線性關(guān)系。(6)精密度試驗(yàn):精密吸取對(duì)照品溶液10μl，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果RSD為3．08%，表明本方法精密度良好。(7)重復(fù)性試驗(yàn):取同一批號(hào)(20100810)樣品，共5份，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取10μl進(jìn)樣，在上述色譜條件下，樣品中梓醇的平均含量為2．5236mg/g，RSD為2．25%，表明此方法重復(fù)性良好。(8)穩(wěn)定性試驗(yàn):精密吸取同一供試品溶液(批號(hào)20100810)10μl，分別于0、2、4、8、12h 進(jìn)樣。結(jié)果 12h 內(nèi)梓醇峰面積的RSD(n=5)為1．26%，表明供試品12h內(nèi)穩(wěn)定。(9)加樣回收率試驗(yàn):取已知含量的生地黃(批號(hào)20100810)約0．5g，精密稱定，分別精密加入一定量的梓醇對(duì)照品，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法及色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果梓醇的平均回收率為98．47%，RSD為0．67%(n=5)。

結(jié) 果

1．生地黃止血作用多指標(biāo)含量測(cè)定方法的建立:經(jīng)過方法學(xué)考察，確定生地黃止血作用多指標(biāo)含量測(cè)定的色譜條件為:色譜柱:Akasil－C18柱(250mm×4．6mm，5μm)，流動(dòng)相:乙腈(A)－ 水(B)梯度洗脫，0～5minA 由0．3%升至 1．0%，5 ～10min 1．0%升至2．6%，10 ～16min 2．6%，16 ～32minA 由 2．6% 升至8．0%，32～40minA由8%升至15%，40～65minA由15%升至30%;檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm;柱溫:30℃;流速:1ml/min。梓醇在0．13 ～2．60μg呈良好的線性關(guān)系(r=0．9999)，平均回收率為 98．4%，RSD 為 0．67%。表明所建方法簡(jiǎn)便，測(cè)定結(jié)果可靠。HPLC色譜圖見圖1。

圖1 生地黃止血作用的HPLC指紋圖譜

2．樣品含量測(cè)定:取本品3批樣品，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依上述色譜條件測(cè)定，采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算樣品中各指紋峰相對(duì)于梓醇的含量，結(jié)果見表1。

表1 樣品中各指紋峰相對(duì)于梓醇的含量測(cè)定(n=3)

討 論

中藥指紋圖譜是指應(yīng)用色譜及其聯(lián)用技術(shù)最大限度地獲取有用的化學(xué)信息，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的理論與方法，進(jìn)行數(shù)據(jù)解析和特征信息的提取，合理優(yōu)化、量化指紋圖譜，建立多模式多柱色譜、多元檢測(cè)、多水平評(píng)價(jià)的系統(tǒng)方法。其對(duì)控制中藥及其制劑的質(zhì)量控制起到了一定的積極作用。但是中藥指紋圖譜在質(zhì)量控制方面仍存在一定的局限性。如果能將中藥的指紋圖譜與藥效結(jié)合進(jìn)行研究，這樣既能確保中藥產(chǎn)品的有效、安全和穩(wěn)定可控;同時(shí)又與中藥自身的特色相契合，是當(dāng)前在中藥質(zhì)控方面進(jìn)行研究的科技工作者所面臨的共同問題。目前正逐步發(fā)展起來的“譜”與“效”的相關(guān)研究在未來有可能成為解決這一難題的“鑰匙”［4］。基于以上原因，筆者在對(duì)生地黃止血作用物質(zhì)基礎(chǔ)篩選的基礎(chǔ)上，建立了生地黃止血作用的指紋圖譜［3，5］。為了對(duì)指紋圖譜進(jìn)行定量分析，選擇了以梓醇為基準(zhǔn)峰，其他峰的面積與梓醇峰面積進(jìn)行比較，得到各指紋峰的相對(duì)含量，這樣一方面可以有效控制制劑的質(zhì)量，同時(shí)又解決了其他對(duì)照品難以獲得，致使含量無法測(cè)定的問題。

1 國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典(一部)［S］．北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:115－116

2 謝琦敏，葉忠偉．張仲景運(yùn)用地黃功用探討［J］．浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，33(6):742 －743

3 郭東艷，張麗娟，王梅，等．生地黃止血有效部位HPLC指紋圖譜研究［J］．中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(4):90 －92

4 陳洪淵．中藥譜效相關(guān)研究的思路與方法［J］．中國(guó)天然藥物，2010，8(3):161

5 王梅，張麗娟，郭東艷，等．生地黃止血作用藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的初步研究［J］．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011，22(6):1938 －1939