菊米提取液對(duì)人胃癌細(xì)胞AGS增殖和凋亡的影響

司馬軍 金晨宇 方迪龍 金哲柱 鄭鳴之

菊米多為菊科植物甘野菊(chrysanthemum seticuspe)的花蕾制作而成。據(jù)《增廣本草綱目》記載，菊米為處州一種山中野菊，土人采其蕾(蕊)干之，如半粒綠豆大，甚香且清圓黃亮。目前被廣泛用于保健茶飲。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)菊米富含揮發(fā)油、蛋白質(zhì)、菊米內(nèi)脂、野菊花素、黃酮等營(yíng)養(yǎng)成分，也含有小白菊內(nèi)酯、木犀草素、芹菜素、萜類(lèi)化合物等成分。已有研究證實(shí)［1～5］，菊米提取液可通過(guò)影響 NO 途徑，增加 NOS活性和內(nèi)皮細(xì)胞超極化因子(EDHF)釋放，發(fā)揮舒張血管、對(duì)抗實(shí)驗(yàn)性心律失常和心肌缺血再灌注損傷等作用;小白菊內(nèi)酯可抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞的增殖;萜類(lèi)化合物可誘導(dǎo)人肝癌SMMC－7721細(xì)胞凋亡;木犀草素、芹菜素等可通過(guò)抗增殖和誘導(dǎo)凋亡抑制惡性腫瘤細(xì)胞的增長(zhǎng)［6，7］。故推測(cè)，菊米提取液可能對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，為此筆者將不同濃度的菊米提取液與人胃癌細(xì)胞AGS共同培養(yǎng)，觀察其對(duì)AGS細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

材料與方法

1．材料:人胃癌細(xì)胞AGS購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，野菊米購(gòu)自遂昌華昊菊米有限公司，DMEM(dulbeccos modified eagle medium)細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)自 Gibco公司，噻唑藍(lán)(thiazole blue，MTT)、碘化丙啶(propidium iodide，PI)及二甲基亞砜(DMSO)均購(gòu)自 Sigma公司，casapase－3/7、casapase－6活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Promega公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物制品公司。菊米提取液的制備:取干的野菊米加入10倍的無(wú)水乙醇室溫萃取24h，過(guò)濾去沉淀，上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮即可。

2．MTT法測(cè)定細(xì)胞生存率:用含2%FBS(fetal bovine serum)的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至3×104個(gè)/毫升，按180微升/孔(6×103個(gè)左右細(xì)胞量)接種于96孔板中，16h后給予各種不同處理并于37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)48h。然后各孔中按1∶9加入5mg/ml MTT(用 pH 7．4 PBS配制)，再置37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去上清液，加入DMSO 150微升/孔，搖床30min后，在酶聯(lián)檢測(cè)儀上570nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度(A)值，以A值間接反映存活細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(1－A給藥/A對(duì)照)×100%。

3．細(xì)胞凋亡測(cè)定:采用PI單染分析法用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期以反映細(xì)胞凋亡情況。收集各處理組細(xì)胞均勻打散，PBS(phosphate buffer saline)沖洗3次后于70%乙醇中4℃固定18h，洗去乙醇，加入RNase(50mg/ml)消化并用PI(100mg/ml)染色30min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞亞二倍體凋亡峰，根據(jù)此亞二倍體峰計(jì)算凋亡細(xì)胞的百分率。

4．caspase－3/7，caspase－6活性分析:具體操作根據(jù) Promega試劑盒說(shuō)明書(shū)，即將細(xì)胞均勻接種于96孔板中，給予不同處理后，各孔加入與培養(yǎng)基等體積的caspase－3/7，caspase－6發(fā)光底物(分別為Z－DEVD－R110，Z－VEID－氨基螢光素)，輕輕搖勻30s，室溫孵育3h后于多功能熒光分析儀Wallac 1420 Explorer上測(cè)量螢光值(relative light units，RLU)。

結(jié) 果

1．菊米提取液對(duì)AGS細(xì)胞增殖的影響:隨藥物質(zhì)量濃度0．001～0．010mg/ml增加，細(xì)胞的增殖抑制率逐漸上升，且與菊米提取液質(zhì)量濃度呈正相關(guān)(r=0．905，P ＜0．05)，0．01mg/ml時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用最大，達(dá)到(58．32 ±2．68)%(圖1)。

2．菊米提取液對(duì)AGS細(xì)胞凋亡的影響:AGS細(xì)胞與含有菊米提取液0.001～0．010mg/ml的完全培養(yǎng)基或不含藥的完全培養(yǎng)基共同培養(yǎng)48h后，收集全部培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，不含藥的對(duì)照組細(xì)胞凋亡發(fā)生率為(1．77±0．60)%，含菊米提取液0.001、0．002、0．005、0．010mg/ml的藥物組細(xì)胞凋亡率分別為(4．63 ± 1．45)%、(11．03 ± 2．01)%、(15.53 ±1．96)%及(23．77 ±1．65)%。與對(duì)照組相比，除了0．001mg/ml藥物濃度組，其余3個(gè)藥物濃度組均顯著提高了細(xì)胞凋亡率(p＜0．05)，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性(圖2)。

3．菊米提取液對(duì) caspase－3/7、caspase－6酶活性的影響:AGS細(xì)胞與含有菊米提取液 0．001～0.01mg/ml的完全培養(yǎng)基或不含藥的完全培養(yǎng)基共同培養(yǎng)48h后，與對(duì)照組相比，除了0．001mg/ml藥物濃度組，其余 3個(gè)藥物濃度組的 caspase－3/7、caspase－6酶活性均有顯著增加(p＜0．05)，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性(圖3)。

討 論

誘導(dǎo)和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡是治療腫瘤的重要策略之一［8］。臨床上常用的化療藥物多具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，但不良反應(yīng)較大，也易產(chǎn)生耐藥性。因此，從天然植物中獲取不良反應(yīng)小、不易產(chǎn)生耐藥性的抗癌新藥越來(lái)越受到人們的重視。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，菊米提取液在體外能明顯抑制胃癌細(xì)胞AGS生長(zhǎng)，而且這種作用出現(xiàn)一定的濃度依賴(lài)性。菊米提取液對(duì)胃癌AGS細(xì)胞的增殖抑制率隨著濃度的增加而增加(P ＜0．05)，在4．713×10－3mg/ml可使半數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制，這可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)菊米提取液對(duì)AGS細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，菊米提取液可隨著濃度的增加而增大細(xì)胞凋亡率，0．01mg/ml的菊米提取液處理AGS細(xì)胞48h后，其細(xì)胞凋亡率為對(duì)照組的13．5倍。在對(duì)AGS細(xì)胞caspase－3/7酶及caspase－6酶活性的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了菊米提取液可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

圖3 菊米提取液對(duì)胃癌AGS細(xì)胞caspase－3/7、caspase－6酶活性的影響

細(xì)胞凋亡是基因控制的細(xì)胞自主性死亡過(guò)程，它是在基因調(diào)控下的一個(gè)嚴(yán)密完整的程序過(guò)程。其中caspase家族在凋亡過(guò)程中起到關(guān)鍵性的作用，能引起細(xì)胞在形態(tài)和生物學(xué)特性的改變。caspase－3、caspase－7與caspase－6是主要的處于細(xì)胞凋亡下游的凋亡效應(yīng)分子。caspase－3被稱(chēng)為“死亡蛋白酶”，是細(xì)胞凋亡的生物學(xué)標(biāo)志，其活化及活性受到多種因素的調(diào)節(jié)。已有研究表明，caspase－7與caspase－3在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的過(guò)程存在正相關(guān)，但在細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中 caspase－7究竟位于caspase－3 的下游，還是平行關(guān)系，意見(jiàn)不一［9］。caspase－6參與細(xì)胞凋亡的執(zhí)行并可降低凋亡信號(hào)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的閾值，其與caspase－3二者有38%同源性，二者是不同凋亡途徑共同的下游路徑，但二者的調(diào)控機(jī)制及相互關(guān)系并不十分明確。有研究發(fā)現(xiàn)，caspase－3蛋白早于caspase－6蛋白的激活，并與caspase－6蛋白的活化有密切關(guān)系，活化的caspase－6蛋白反過(guò)來(lái)又能活化caspase－3蛋白，形成對(duì)caspase－3蛋白活化的正性循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)顯示，隨著菊米提取液濃度的增加，用熒光底物檢測(cè)法觀察到caspase－3/7酶和caspase－6酶活性的改變呈劑量依賴(lài)性增高，0．01mg/ml的菊米提取液處理AGS細(xì)胞48h，其酶活性分別為對(duì)照組的4．3倍和2．0倍。提示caspase－3/7基因和caspase－6蛋白基因的蛋白翻譯水平同樣可能是菊米提取液的作用位點(diǎn)，菊米提取液可能通過(guò)增加caspase－3/7、caspase－6蛋白表達(dá)、活化而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。有關(guān)caspase家族在細(xì)胞凋亡過(guò)程中的相互作用機(jī)制，還有待今后進(jìn)一步的深入研究。

自由基導(dǎo)致DNA損傷且抑制損傷后的修復(fù)，是自由基誘導(dǎo)細(xì)胞癌變的主要原因。以往的研究結(jié)果顯示，菊米提取液可通過(guò)增加內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的一氧化碳合酶(nitric oxide synthase，NOS)，使NO生成增加而發(fā)揮舒張血管的作用，該結(jié)果提示菊米提取液具有抗氧化的作用［2］。因此，菊米提取液的抗氧化能力也可能是其抗腫瘤的機(jī)制之一，這有待進(jìn)一步深入研究。

目前關(guān)于菊米提取液抗胃癌機(jī)制的相關(guān)研究還不多。本研究顯示，菊米提取液能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS凋亡，抑制其增殖。為菊米提取液今后用于臨床治療胃癌提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 徐策，葉挺梅，朱立，等．菊米提取液抗實(shí)驗(yàn)性心律失常作用的研究［J］．中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2007，23(4):399－402

2 葉挺梅，徐和靖，汪洋，等．菊米提取液舒張血管作用及其機(jī)制研究［J］．中國(guó)病理生理雜志，2007，23(4):644－647

3 葉挺梅，陳文良，朱立，等．菊米提取液對(duì)抗心肌再灌住損傷［J］．中國(guó)病理生理雜志，2008，24(12):2328－2332

4 翁少翔，單江，徐耕，等．小白菊內(nèi)酯抑制胎牛血清誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理［J］．中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2002;16(5):331－335

5 張琪，王勤，苗瑞東，等．盤(pán)花垂頭菊中兩種新型倍半萜類(lèi)化合物抑制人肝癌 SMMC－7721細(xì)胞生長(zhǎng)［J］．藥學(xué)學(xué)報(bào)，2002，37(12):993－995

6 張芳芳，沈漢明，朱心強(qiáng)．木犀草素抗腫瘤研究作用的進(jìn)展［J］．浙江大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2006，35(5):573－578

7 胡太平，曹建國(guó)．芹菜素誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞凋亡作用及機(jī)制研究［J］．國(guó)際病理科學(xué)與臨床雜志，2007，27(1):6－11

8 Gazitt Y，Akay C．Arsenic trioxide:An anticancer missile with multiple warheads［J］．Hematology，2005，10(3):205 － 213

9 胡會(huì)華，周士福，李青國(guó)．新輔助化療中凋亡效應(yīng)因子caspase－7、caspase－3及凋亡抑制因子survivin關(guān)系初探［J］．中國(guó)綜合臨床，2007，23(10):896－898