三葉青提取物聯(lián)合介入治療兔VX2肝癌模型多層螺旋CT表現(xiàn)及肝功能動態(tài)分析

賈玉柱 勞 群 祁克信 陸海華 楊光釗 魏克民

肝癌的早期治療仍首選手術(shù)切除，但對中晚期 常伴有較嚴重肝硬化的肝癌病例，綜合治療已成為共識［1］。利用中藥聯(lián)合介入技術(shù)治療中晚期肝癌的綜合治療，是近年來研究的新熱點［2］。

三葉青為葡萄科崖爬藤屬植物，學名為三葉崖爬藤，生于陰濕山坡、山溝中，具有清熱解毒、祛風化痰、活血止痛的功能，主要用于治療高熱驚厥、肺炎、肝炎、腫瘤等［3］。本研究采用三葉青提取物灌胃及碘油+化療藥物肝動脈灌注對兔VX2肝癌模型的抑瘤作用做動態(tài)影像學實驗研究，通過對腫瘤大小、生長率、壞死率以及CT值強化程度的動態(tài)影像學觀察，以及GPT、GOT等肝功能方面的研究，以病理為最終驗證，為臨床三葉青抗腫瘤研究提供動態(tài)的影像學實驗資料，為中藥結(jié)合肝動脈碘油化療藥物栓塞術(shù)(transluminal arterial cheminal embolization，TACE)方法綜合治療肝腫瘤提供實驗依據(jù)。

材料與方法

1．實驗動物:健康新西蘭大白兔33只，雌雄不限，體重2.0～2．5kg，由浙江省實驗動物中心，生產(chǎn)許可證:SCXK(Z)2009－0039。

2．VX2瘤株制備與瘤兔接種:(1)VX2瘤株制備:VX2瘤株由溫州醫(yī)學院動物實驗中心惠贈。實驗兔采用1%戊巴比妥鈉溶液(1ml/kg)經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉后，仰臥固定自制手術(shù)臺上，消毒鋪巾后，切取瘤塊邊緣旺盛的魚肉樣VX2腫瘤組織，放置與預先配置好的生理鹽水中(50ml生理鹽水+80mg慶大霉素)，去除壞死組織和結(jié)締組織后，用眼科剪剪成約1mm×1mm×1mm小塊瘤株。用1ml針筒抽取制備好瘤細胞液體1ml，連接3F穿刺針，將VX2鱗癌瘤株接種兔腹股溝區(qū)皮下或肌內(nèi)使之成瘤并以之傳代。余下瘤細胞用生理鹽水配制成VX2瘤組織混懸液約1×106個/毫升。(2)兔VX2移植瘤的種植:將麻醉固定好的實驗兔，備皮左上胸腹部，CT定位下選取肝臟最大層面做腹部皮膚標記，聚維酮碘消毒3次，消毒約直徑10cm范圍，鋪無菌巾，切開腹腔將兔肝左中央葉充分暴露，挑開肝包膜將懸液用16號針頭注入肝實質(zhì)內(nèi)接種。術(shù)后給予慶大霉素8萬U肌內(nèi)注射，連續(xù)3天抗感染。接種2周后備用。(3)藥品:三葉青原料，華東醫(yī)藥公司中藥分公司提供(鑒定為Tetrastigma hemsleyanum Diels et．Gilg)，粉碎過100目篩。(4)三葉青提取物制備:將10kg三葉青分別加乙醇80L提取3次，每次2h，合并提取液，回收溶劑，得濃縮液。濃縮液用2倍量乙酸乙酯萃取3次后合并溶劑，揮干溶劑，冷凍干燥，得到三葉青乙酸乙酯提取物。

3．實驗方法:瘤兔隨機分為 A、B、C 3組，A組:三葉青聯(lián)合介入治療組;B組:單純介入治療組;C組:對照組，每組11只，雌雄不限，肝癌模型種植后A組瘤兔于造模后術(shù)后8天開始用三葉青提取物灌胃，2周后聯(lián)合介入治療;B組瘤兔2周后單純介入治療;C組2周后動脈灌注生理鹽水。瘤兔接種瘤株14天后，A、B、C 3組荷瘤兔用1%戊巴比妥鈉1ml/kg體重全麻后，固定于手術(shù)臺上，常規(guī)準備。根據(jù)腹股溝區(qū)血管走向縱行切開皮膚，分離開的股動脈3cm置入導絲，退出穿刺針后引入4F導管，于T11間隙主動脈處注入對比劑，尋找腹腔干開口，了解肝血管走行，3F同軸微導管在微導絲導向下，送達肝總動脈處，手推造影顯示腫瘤血供情況，進行腫瘤供血動脈的超選，造影證實腫瘤染色后按分組要求注入藥物:1mg/kg阿霉素與0．2mg/kg超液態(tài)碘油。術(shù)后拔出導管，加壓包扎切口，術(shù)后肌內(nèi)注射青霉素抗感染3天。C組僅動脈灌注生理鹽水。

4．觀察指標及方法:兔VX2肝癌模型肝CT掃描前的實驗室檢查:GPT、GOT肝功能指標。肝CT掃描:采用1%戊巴比妥鈉麻醉后，運用GE16排螺旋CT機，120kV，200mA，層厚3mm，Pitch1．5mm，F(xiàn)OV480mm，后處理重建 1．5mm，造影劑采用碘海醇4ml，經(jīng)耳緣靜脈快速推注，立即作CT增強掃描。調(diào)整窗寬窗位，測量腫瘤大小、單位面積平掃及增強平均CT值，注意盡可能同層同部位測量，測量3次，取平均值，以確保對比數(shù)據(jù)的可靠性和準確性。治療后14天CT掃描后記錄腫瘤大小，腫瘤體積大小按照V=1/2ab2(a為最大徑，b為最小徑)，計算腫瘤生長率，腫瘤生長率(growth rate，GR)=V治療后/V治療前×100%;14天后處死兔子，10%的甲醛固定，石蠟包埋切片，每份標本在腫瘤最大層面做病理切片，光鏡觀察并用圖像采集系統(tǒng)采集圖像。結(jié)合光鏡觀察和采集圖像的測量，計算出腫瘤壞死區(qū)域和整個腫瘤的面積，二者之比即為腫瘤組織壞死率;組織病理學表現(xiàn)，包括大體變化，轉(zhuǎn)移情況，HE染色觀察腫瘤以及周邊正常肝組織的變化。

結(jié) 果

標本切面見C組色澤灰紅、鮮嫩魚肉狀外觀，中心少量液化壞死;B組邊緣色澤暗紅、如老化魚肉狀外觀，中心液化壞死較C組較重;A組質(zhì)地明顯軟化，中央大片灰黃色凝固壞死，凝固壞死區(qū)并有液化壞死腔及“瘀泥”樣壞死物。腫瘤壞死率:A組(67．23±7．26)%;B 組(52．35 ± 6．27)%;C 組(42．67 ±7.38)%。結(jié)果示單純介入治療，介入治療聯(lián)合三葉青提取物治療，不予治療均可引起腫瘤壞死，壞死率3組間比較均有顯著性差異(p＜0．01)，介入治療聯(lián)合三葉青提取物治療腫瘤壞死率最高(表1)。A組與B組荷瘤兔腫瘤體積及CT值變化有統(tǒng)計學差異(p＜0．05)(表1、表2)，治療后A組血清GTP、GOP較B組低，與B組相比有統(tǒng)計學意義(p＜0．05)(表3)。

表1 3組治療前后VX2兔腫瘤體積變化及生長量(n=11

表1 3組治療前后VX2兔腫瘤體積變化及生長量(n=11

治療前后VX2兔腫瘤體積比較，*p＜0．05;腫瘤生長率A、B、C組間比較，※P ＜0．05，腫瘤壞死率 A、B、C 組間比較，ΔP ＜0．05

組別 治療前體積(cm3)治療后兩周體積(cm3)生長率(%)壞死率(%)A 組 1．35 ±0．22 2．23 ±0．26* 165．2 ±17．45※ 67．23 ±7．26Δ B 組 1．32 ±0．28 3．48 ±0．24* 263．6 ±15．23※ 52．35 ±6．27Δ C 組 1．37 ±0．21 4．75 ±0．32* 346．7 ±16．42※ 42．67 ±7．38Δ

表2 3組VX2兔腫瘤平均CT值變化(HU)

表3 3組治療前后血清GPT、GOT量表(IU/L)(n=11

表3 3組治療前后血清GPT、GOT量表(IU/L)(n=11

治療后血清 GPT、GOT 量 A、B、C 組間比較，*P ＜0．05

組別GPT GOT術(shù)前 術(shù)后2周 術(shù)前 術(shù)后2周A 組 40．65 ±5．78 56．48 ±7．84* 35．94 ±7．41 44．31 ±6．23*B 組 38．87 ±6．54 80．45 ±6．74* 37．26 ±3．48 60．74 ±7．54*C 組 40．45 ±5．64 120．26 ±8．84* 36．81 ±36．91 135．28 ±6．53*

討 論

惡性腫瘤目前在醫(yī)學界尚無理想的藥物和方法，肝癌是常見的惡性腫瘤，手術(shù)切除被公認為肝癌根治的首選方法，但至今手術(shù)切除率仍不足30%，在手術(shù)切除的患者中，有30% ～70%出現(xiàn)肝癌復發(fā)和轉(zhuǎn)移［4］。目前TACE已經(jīng)成為肝癌治療行之有效的方法［5］。但目前使用的化療藥，主要作用機制是阻止脫氧核糖核酸、核糖核酸或蛋白質(zhì)的合成，或者直接對這些高分子發(fā)生作用，這些藥物毒性大，對機體免疫力、肝腎功能等都有不同程度的損傷，尤其不適合應用于肝硬化合并肝癌的治療，而且，化療藥對腫瘤細胞耐藥性日益增加，加重了病人和國家的經(jīng)濟負擔［6］。

近些年來，用于對VX2兔肝癌生長情況檢測的方法有B超、CT、MRI、DSA等，這4種方法都有一定的優(yōu)缺點［7］。本研究結(jié)果表明，CT檢查方便、簡單，直觀性好，可重復性強，可直觀準確地觀察移植瘤生長情況。本模型生物學行為與人類的原發(fā)性肝癌相同或相近，可以模擬人類肝細胞肝癌，CT表現(xiàn)類似于人類肝細胞性肝癌“快進快出”的強化特點。種植后2周平掃腫瘤與周圍肝臟實質(zhì)分界清楚，呈低密度或等密度，增強掃描動脈期強化明顯(CT值增加35HU左右)，與病理上所見癌細胞巢內(nèi)富含多量薄壁血管相一致;多數(shù)可見增粗的供血動脈直達腫瘤邊緣并向瘤組織內(nèi)延伸，周圍正常肝臟實質(zhì)期強化明顯(CT值增加40HU左右)，與以往報道類似。如果腫瘤較大超過2．5cm以上，中心可出現(xiàn)液化壞死，表現(xiàn)為環(huán)狀強化特征，后經(jīng)病理證實與以往報道相似。

研究表明，三葉青乙酸乙酯提取物對腫瘤細胞具有很好的細胞毒作用，對正常原代大鼠細胞毒性較小，三葉青急性毒性試驗和長期毒性試驗證實，三葉青高劑量組為人體推薦劑量的120倍，試驗證實安全無毒;對小鼠TNF－α、IFN－γ具有上調(diào)作用，具有增強小鼠的細胞免疫和體液免疫功能［8］。本實驗3組螺旋CT顯示三葉青提取物組對VX2瘤兔的治療前后VX2兔腫瘤體積增長減小，生長率減低，壞死率增高，平均CT值變化較其他兩組均有差異，對VX2瘤兔血清肝功能有效的改進，病理組織學顯示三葉青治療組壞死率高，且為凝固性壞死多見，周圍腫瘤組織軟化明顯較其他組魚肉狀外觀有所不同。本研究發(fā)現(xiàn)三葉青提取物不但在腫瘤進展方面可以做到有效的控制，而對于VX2瘤兔有良好護肝保肝的作用，三葉青提取物有其獨特的保肝護肝作用，與介入療法的聯(lián)合應用，兼顧了整體與局部、宿主與癌腫、癥狀與疾病等方面，取長補短，使治療方案更加全面合理，真正起到了遏制腫瘤生長及減毒增效的作用。

1 中華醫(yī)學會中華放射學雜志編委會介入放射學組．肝癌介入治療規(guī)范化條例(草案)［J］．中華放射學雜志，2001，35(12):888

2 李淼，李銘．肝癌中藥介入治療的應用基礎(chǔ)與臨床研究現(xiàn)狀［J］．北京中醫(yī)藥，2009，28(2):146 －147

3 何福根．三葉青抗腫瘤作用及其機制研究進展［J］．腫瘤學雜志，2010，6(1):75 －77

4 Cross D，Burmester JK．Gene therapy for cancer treatment:past，present and future［J］．Clin Med Res，2006，4:218 － 227

5 肖運平，肖恩華．介入治療在防治肝癌術(shù)后復發(fā)中的作用及進展［J］．介入放射學雜志，2008，17(11):831 －834

6 姜憲輝，葉華．原發(fā)性肝癌127例介入治療的臨床研究［J］．臨床醫(yī)學工程雜志，2008，15(10):19 －20

7 韓志剛，程紅巖，胡海洋，等．兔VX2肝癌模型的制作及CT，MRI表現(xiàn)［J］．中國介入影像與治療學，2007，4(1):61－65

8 汪珍，馮健，王曉華，等．三葉青提取物對人結(jié)腸癌細胞系RKO細胞凋亡的影響［J］．浙江中醫(yī)藥大學學報，2008，32(3):321－322，324