白木通籽分離蛋白的理化與功能性質(zhì)研究

史 卿，杜研學(xué)，趙 強(qiáng)，阮 霞，熊 華，鐘紅蘭，白春清，黃聲芳

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047)

白木通(Akebia trifoliate(Thunb.)Koidz.var.australis(Diels)Rehd)屬于木通科木通屬植物，據(jù)《中國(guó)藥典》2005版一部記載，其干燥莖藤入藥可作木通用，味苦，性寒，具利尿、活血通脈、抗菌消炎之功效［1］。白木通果肉呈乳白色，含豐富的淀粉和可溶性糖，味美可食，果肉中含17種氨基酸，蛋白質(zhì)總量為0.98g/100g，維生素 C含量高達(dá)84mg/100g，另外還含豐富的鈣、鈉、鋅、鎂、鉀等礦質(zhì)元素［2］，其果肉的營(yíng)養(yǎng)成分結(jié)構(gòu)與沙棘大體相當(dāng)。據(jù)醫(yī)學(xué)研究表明，白木通莖藤具利尿、鎮(zhèn)痛和抗炎的作用。白梅榮等［3］通過(guò)大鼠代謝籠法、體外抑菌實(shí)驗(yàn)、小鼠耳腫脹法研究比較三葉木通和五葉木通的水煎劑利尿、抑菌和抗炎作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種木通的利尿等藥理作用基本相同。除此之外，木通中還具有抗癌功效的成分。白木通果無(wú)毒。江西省很多地區(qū)，如九江、萍鄉(xiāng)、撫州等地，長(zhǎng)期以來(lái)白木通都作為野生水果被食用，囊肉可用于熬糖;根、莖、葉可以泡茶;皮、籽、根、莖和葉均可入藥。江西省科研技術(shù)人員通過(guò)采集白木通野生藤，經(jīng)過(guò)多年馴化種植，已經(jīng)培育出高產(chǎn)油、高結(jié)果率的新白木通果，平均產(chǎn)量可達(dá)3000斤/畝，最高產(chǎn)量可達(dá)6000斤/畝。通過(guò)對(duì)白木通籽和果皮基本組成進(jìn)行成分分析，證明白木通是非常有價(jià)值的資源，急需開(kāi)發(fā)利用。白木通籽是一種油料籽，有關(guān)部門(mén)已將其作為一種特種油來(lái)開(kāi)發(fā)以緩解國(guó)內(nèi)食用油資源緊張的壓力。白木通籽中油脂含量為39.33%、粗蛋白含量為17.89%［4］，經(jīng)提取油脂后，其餅粕中含有大量的蛋白(約42%)，為提高木通籽的綜合利用，急需對(duì)蛋白進(jìn)行開(kāi)發(fā)研究。本文以白木通籽為原料，利用經(jīng)典的堿提酸沉法，制備了白木通籽分離蛋白，系統(tǒng)的探討了蛋白的理化性質(zhì)、功能性質(zhì)及評(píng)價(jià)，旨在初步研究白木通籽蛋白的物化特性，為其應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白木通籽 廬山東林寺果園;大豆油 市售;牛血清白蛋白 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司;四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、三羥甲基胺基甲烷(Tris)、1－苯胺基萘－8－磺酸(ANS)、β－巰基乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、溴酚藍(lán)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀等試劑 均為分析純。

KDY－9820凱氏定氮儀 廈門(mén)精藝興業(yè)科技有限公司;FD－1冷凍干燥機(jī) 北京神泰偉業(yè)儀器設(shè)備有限公司;LXJ－IIB離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;RH basic 1磁力攪拌器、高速分散勻漿機(jī) 德國(guó)IKA公司;新世紀(jì)T6紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司;L8800氨基酸自動(dòng)分析儀、F－4500熒光分光光度計(jì) 日本日立公司;SPX－250電泳儀 美國(guó)伯樂(lè)公司;MOS－450圓二色光譜儀 法國(guó)Bio－Logic公司;Quanta200F電子掃描顯微鏡 美國(guó)FEI公司;精密pH計(jì) 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料前處理 白木通籽干燥去除水分后，手工去皮，粉碎過(guò)篩，按固液比1∶3加入正己烷室溫下磁力攪拌脫脂2h，重復(fù)三次，離心、烘干正己烷后得到脫脂白木通籽粉(DAF)。

1.2.2 白木通籽分離蛋白(API)的制備 采用堿提酸沉法制備白木通籽分離蛋白:50g DAF溶解至500mL蒸餾水中，用1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至10.0，溫度35℃，在磁力攪拌器上攪拌提取1.5h后離心(5000×g，15min)，殘?jiān)貜?fù)提取2次，合并上清液。用1mol/L HCl調(diào)節(jié)上清液pH至4.5，4℃靜置30min后離心(5000×g，15min)棄去上清液，水洗，調(diào)pH至7.0后置于超低溫冰箱中－80℃預(yù)凍過(guò)夜，后置于真空冷凍干燥箱中干燥。

1.2.3 白木通籽化學(xué)組成分析 采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)樣品的水分、灰分、蛋白、脂肪和纖維素進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 氨基酸組成及評(píng)價(jià) 稱取白木通籽分離蛋白0.25g，將樣品置于水解管中，加入含有10mmol/L多酚的6mol/L鹽酸溶液，真空封口。在110℃下水解24h，冷卻后定容、過(guò)濾和蒸干，采用氨基酸自動(dòng)分析儀上樣測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸含量。氨基酸含量以g/100g蛋白表示。

1.2.4.1 氨基酸評(píng)分(%) 以 FAO/WHO(2007)［5］小孩推薦模式為參考按照如下公式計(jì)算:

1.2.4.2 九種必需氨基酸的數(shù)量與總氨基酸的數(shù)量之比 E/T(%)。

1.2.4.3 蛋白質(zhì)功效比值(PER)的估算 Alsmeyer［6］等人提出的回歸方程計(jì)算:

1.2.4.4 蛋白質(zhì)生物價(jià)(BV)的估算 根據(jù)Morup和Olesen［7］提出的回歸方程計(jì)算:

1.2.5 十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)分析 參考 Laemmli方法［8］采用不連續(xù)緩沖液系統(tǒng)，濃縮膠和分離膠質(zhì)量濃度分別為5%和12.5%。蛋白樣品溶解于0.05mol/L Tris－HCl緩沖溶液(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的SDS，1%的β－巰基乙醇，40%的蔗糖和0.02%的溴酚藍(lán))中配制成質(zhì)量濃度1mg/mL的溶液，樣品上樣前在沸水中加熱5min，離心(10000×g，10min)。取上清液10μL進(jìn)樣，電泳在室溫條件下，濃縮膠中電流恒定為15mA，當(dāng)樣品前沿到達(dá)分離膠時(shí)電流改為25mA。電泳結(jié)束后，用0.05%考馬斯亮藍(lán)R－250溶液(染料溶解于體積比為46∶227∶227的冰乙酸、甲醇和水混合溶液中)染色3h，后用體積比為50∶75∶875的甲醇、乙酸和水混合溶液對(duì)凝膠脫色6h。蛋白標(biāo)品的分子量范圍15～170ku。

1.2.6 掃描電鏡(SEM)觀察 采用FEI公司的Quanta 200F型電子掃描顯微鏡(Scanning Electron Microscope，SEM)對(duì)蛋白顯微形態(tài)進(jìn)行觀察。蛋白樣品經(jīng)過(guò)粘臺(tái)、噴金等步驟后，在加速電壓為20kV的條件下用SEM進(jìn)行觀察。

1.2.7 圓二色譜分析 蛋白樣品的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成采用法國(guó)Bio－Logic公司的MOS－450型旋光分光計(jì)測(cè)定。稱取一定質(zhì)量的蛋白樣品，分散于10mmol/L磷酸緩沖液(pH7.2)中使蛋白質(zhì)量濃度為0.1mg/mL。測(cè)定前過(guò)微孔濾膜(0.45μm)，采用遠(yuǎn)紫外區(qū)CD光譜，掃描范圍為190～250nm，樣品池光程1mm，每個(gè)樣品掃描三次取平均值，測(cè)定參數(shù):分辨率1nm，捕獲時(shí)間1s，帶寬0.5nm，靈敏度100mdeg/cm。以磷酸緩沖液為空白對(duì)照［9］。

1.2.8 溶解度 將蛋白樣品溶于蒸餾水中，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的蛋白溶液，于磁力攪拌器上攪拌30min使其充分分散，而后用 0.5mol/L鹽酸或0.5mol/L氫氧化鈉將溶液pH分別調(diào)至2～12，25℃繼續(xù)攪拌溶解30min后5000×g離心15min。用Lowry法［10］測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)的含量，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。每組實(shí)驗(yàn)做三組平行對(duì)照。

1.2.9 表面疏水性測(cè)定 采用熒光探針劑ANS法［11］。將樣品分散于0.01mol/L、pH7.0磷酸緩沖液中配制成1mg/mL的原液，后用相同緩沖液將其稀釋成50、100、150、200、250μg/mL 五個(gè)系列濃度的溶液。每4mL系列濃度的蛋白溶液加入50μL的1－苯胺基－8－萘磺酸(1－anilino－8－naphthalene sulfonic acid，ANS)溶液(8mmol/L ANS溶于0.01mol/L磷酸鹽緩沖液)?；靹蚝蟛捎脽晒夥止夤舛扔?jì)測(cè)定，操作條件為:激發(fā)波長(zhǎng)390nm，掃描范圍400～700nm，掃描速度500nm/min，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫寬均為3nm。響應(yīng)時(shí)間為0.1s，記錄470nm波長(zhǎng)處的熒光發(fā)射強(qiáng)度，用熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白溶液濃度作圖并進(jìn)行線性回歸，以線性回歸斜率作為表面疏水性的指標(biāo)。每組實(shí)驗(yàn)做三組平行對(duì)照。

1.2.10 起泡性與起泡穩(wěn)定性 參照文獻(xiàn)［12］以不同 pH(3.0、5.0、7.0、9.0)的磷酸緩沖溶液配制20mL質(zhì)量濃度為1%的蛋白溶液，采用高速分散勻漿機(jī)均質(zhì)1min(15000r/min)后，迅速記錄泡沫所占的體積V1;室溫下靜置30min后，再次記錄泡沫的殘余體積V2，每組實(shí)驗(yàn)做三組平行對(duì)照。計(jì)算公式如式5、式 6:

式中:V0為蛋白溶液的體積，即20mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 白木通籽化學(xué)組成分析

對(duì)白木通籽化學(xué)組成進(jìn)行分析，每個(gè)成分測(cè)定三次，取平均值。白木通籽中水分為6.23%，灰分3.58%，粗脂肪38.83%，蛋白質(zhì)17.23%。其中粗脂肪含量與花生中油脂含量相當(dāng)，蛋白質(zhì)含量略高于豆莢中蛋白含量。白木通籽經(jīng)脫皮和脫脂后，油脂和蛋白含量分別為5.12%和41.83%。白木通籽分離蛋白的純度為86.04%，其提取率為82.65%。可見(jiàn)，白木通籽中蛋白含量高，經(jīng)油脂加工后，脫脂粉將會(huì)作為一種新型的豐富植物蛋白資源而被大力開(kāi)發(fā)。

2.2 氨基酸組成及評(píng)價(jià)

表1為白木通籽分離蛋白的氨基酸含量分析結(jié)果，并以FAO/WHO(2007)推薦模式作對(duì)照對(duì)其氨基酸進(jìn)行評(píng)價(jià)。數(shù)據(jù)顯示，白木通籽分離蛋白中谷氨酸和天門(mén)冬氨酸含量最高，分別為17.84g/100g蛋白和11.63g/100g蛋白。必需氨基酸中，與 FAO/WHO(2007)2～5歲小孩的推薦模式相比，白木通籽分離蛋白含較高的纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、組氨酸、賴氨酸和芳香族氨基酸;蘇氨酸和含硫氨基酸含量與之相比較低。然而，此8種必需氨基酸含量均高于FAO/WHO(2007)成人推薦模式。值得一提的是，賴氨酸一般是谷物中的限制性氨基酸，白木通籽分離蛋白中賴氨酸含量為5.91/100g蛋白，明顯高于大米中賴氨酸的含量(3.7g/100g)［13］。白木通籽分離蛋白組分與FAO/WHO(2007)小孩推薦模式相比的氨基酸評(píng)分結(jié)果顯示，蘇氨酸為白木通籽分離蛋白的第一限制性氨基酸，含硫氨基酸為分離蛋白的第二限制性氨基酸。白木通籽分離蛋白E/T值高于FAO/WHO衡量理想蛋白資源的推薦值(36%)，其PER值與優(yōu)質(zhì)蛋白的衡量標(biāo)準(zhǔn)值2.00相比屬于優(yōu)質(zhì)蛋白。

表1 白木通籽分離蛋白氨基酸分析結(jié)果(g/100g蛋白)及其氨基酸評(píng)價(jià)Table 1 Amino acid composition of API and its amino acid score

2.3 SDS－PAGE分析

圖1為白木通籽分離蛋白在還原狀態(tài)下的電泳圖譜。由圖可知，白木通籽分離蛋白的主要亞基分子量范圍為25～35ku。與傳統(tǒng)蛋白資源(如花生、大豆蛋白)相比，白木通籽分離蛋白的亞基分子量較小。

圖1 白木通籽分離蛋白SDS－PAGE電泳圖Fig.1 SDS－PAGE patterns of API

2.4 表面形態(tài)觀察

蛋白提取過(guò)程中，采用不同的萃取液制備的蛋白可能會(huì)呈現(xiàn)不同的分子形態(tài)結(jié)構(gòu)。傳統(tǒng)堿提酸沉法提取得到的白木通籽分離蛋白在400、1600倍的掃描電鏡下的表面微觀結(jié)構(gòu)如圖2所示。白木通籽分離蛋白的分子結(jié)構(gòu)形態(tài)類(lèi)似晶狀體，晶狀體結(jié)構(gòu)比較疏松，分布不均勻，而且表面也不平整。

圖2 API超微結(jié)果Fig.2 Microphotograms of API in SEM

2.5 圓二色譜結(jié)果

采用遠(yuǎn)紫外圓二色光譜測(cè)定白木通籽分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成。結(jié)果顯示，白木通籽分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由11.9%的 α－螺旋，31.2%的 β－折疊，20.3%的轉(zhuǎn)角和36.6%的無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，如表2所示。這說(shuō)明β－折疊和無(wú)規(guī)則卷曲是白木通籽分離蛋白的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)，蕎麥蛋白中也發(fā)現(xiàn)了相類(lèi)似的結(jié)果［14］。

圖3 白木通籽分離蛋白的圓二色譜曲線Fig.3 Circular dichroism spectroscopy of API

表2 白木通籽分離蛋白圓二色譜結(jié)果Table 2 Secondary structures of API

2.6 溶解性

蛋白質(zhì)的溶解性是功能性質(zhì)中最重要的一個(gè)性質(zhì)，它會(huì)極大地影響其他功能性質(zhì)，同時(shí)又受pH的影響。白木通籽分離蛋白溶解性隨pH的變化曲線如圖4所示。白木通籽分離蛋白的溶解性曲線呈現(xiàn)U形，隨著pH的增加，溶解度先降低，而后在pH5～10范圍內(nèi)持續(xù)上升。在pH4～5內(nèi)，蛋白溶解度呈現(xiàn)最低值，此時(shí)白木通籽分離蛋白的溶解度為2.10%。一般而言，蛋白質(zhì)的溶解度在其等電點(diǎn)附近是最低的，越遠(yuǎn)離等電點(diǎn)，溶解性越好。原因是在等電點(diǎn)時(shí)，電荷斥力消失，從而導(dǎo)致蛋白分子表面電荷為零［15］。白木通籽分離蛋白的高溶解性能在 pH達(dá)10.0以上呈現(xiàn)出來(lái)。

2.7 表面疏水性

表面疏水性表明了蛋白質(zhì)分子疏水性區(qū)域的暴露程度，能夠極大地影響蛋白質(zhì)的表面張力和乳化活性。表明疏水性數(shù)值越高，蛋白分子間凝聚作用力越低［16］。白木通籽分離蛋白在pH7.0時(shí)的表面疏水性為379.4。

圖4 白木通籽分離蛋白溶解度隨pH變化情況Fig.4 Solubility of API as influenced by pH

2.8 起泡性與起泡穩(wěn)定性

pH對(duì)蛋白起泡與起泡穩(wěn)定性的影響如圖5所示。一般而言，蛋白質(zhì)的高溶解性是其擁有良好起泡性和起泡穩(wěn)定性的先決條件。蛋白適當(dāng)?shù)娜芙饽軌蛟鰪?qiáng)表面吸附，對(duì)于泡沫的形成十分有利。許多蛋白在等電點(diǎn)附近容易凝聚，從而降低蛋白成膜的穩(wěn)定性［17］。在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿環(huán)境中，由于蛋白質(zhì)表面的靜電荷增多，從而使蛋白質(zhì)的溶解性能和表面活性增強(qiáng)，最終使蛋白的起泡性能得到增強(qiáng)［18］。圖5顯示，起泡性圖像與白木通籽分離蛋白的溶解性曲線呈現(xiàn)高度的相關(guān)性。在pH5.0處，API的起泡性值最低，為10.4%。同時(shí)，API在pH9.0處呈現(xiàn)最高的起泡性值(63.1%)。這種起泡性值隨著pH由5.0增加到9.0上升的現(xiàn)象是由蛋白質(zhì)的柔性增強(qiáng)引起的。蛋白伸展開(kāi)來(lái)使其快速分散到空氣與水界面包埋空氣顆粒，從而使起泡能力增強(qiáng)［19］。

圖5 白木通籽蛋白起泡穩(wěn)定性隨pH變化情況Fig.5 Foaming capacity and foaming stability of API by pH

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用堿提酸沉法對(duì)白木通籽中可溶性蛋白進(jìn)行了提取，并對(duì)其理化性質(zhì)與功能性質(zhì)進(jìn)行了分析。研究表明，白木通籽分離蛋白含17種氨基酸，其中谷氨酸和天門(mén)冬氨酸的含量相對(duì)較高，有貯藏蛋白的共性。蘇氨酸為白木通籽分離蛋白的第一限制性氨基酸。白木通籽分離蛋白的等電點(diǎn)在pH4～5之間，在此pH范圍內(nèi)，蛋白的溶解性和起泡能力均為最低。這些結(jié)果可為白木通籽分離蛋白的開(kāi)發(fā)、可食用植物蛋白質(zhì)的資源開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)，為開(kāi)辟白木通附加值的新途徑提供參考資料。

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