酶解法提取紫玉米多糖技術的研究

魏俊青，劉曉娟，肖春玲

(山西師范大學工程學院，山西臨汾041004)

玉米是世界上產量最高的糧食作物，作為活性多糖的提取原料，它具有明顯的優(yōu)勢［1］。紫玉米因其獨特的色澤和豐富的營養(yǎng)，成為玉米家族中非常珍稀的品種，其含活性糖量比普通玉米高很多，是提取多糖很好的原料。玉米多糖(corn polysaccharide)具有預防便秘、抗腫瘤、減肥降脂、清熱利膽、調節(jié)免疫及預防癌癥等作用［2］，可作為保健食品或保健食品的原料使用，所以越來越受到人們的關注。目前對玉米多糖的研究只是局限于普通玉米的玉米須、玉米皮、玉米芯［3］、玉米花粉和玉米花絲中的多糖等［4］，還沒有見到關于從紫玉米中提取多糖的報道。大量資料表明，目前多糖的提取主要采用熱水浸提、堿浸提、酸浸提等化學方法［5］。隨著生物技術的發(fā)展，酶的來源愈來愈多［6］。本研究主要用酶解法提取紫玉米多糖，以期為紫玉米的進一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

紫玉米 2011年9月7日摘采于山西農業(yè)科學院玉米研究所;纖維素酶(30u/mg)、果膠酶(50u/mg)、木瓜蛋白酶(300wu/mg) 購于華科生化試劑商城，均為日本原裝進口;無水葡萄糖 標準品;無水乙醇、95%的乙醇、濃硫酸、苯酚 為分析純。

UV－1100型紫外－可見分光光度計 上海隆拓儀器設備有限公司;FA－1004型電子天平 上海精科實業(yè)有限公司;pHS－3TC精密數顯酸度計 上海滬粵明科學儀器有限公司;RJ－TDL－40C低速離心機 上海比朗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶解法提取紫玉米多糖 紫玉米粒在65℃下烘干后磨粉，過40目篩，稱取0.5g置于25mL蒸餾水中混勻。在紫玉米粉的渾濁液中加3mL的酶溶液于水浴鍋中反應2h后將溫度調至90℃，靜置30min促使酶鈍化。然后在3000r/min的條件下離心10min，取出上清液，加入95%的乙醇，靜置一晚上，使其充分沉淀［7］。吸出上清液，將剩下的液體在3000r/min的條件下再次離心15min。沉淀用無水乙醇洗滌，干燥后就可以得到粗多糖，稱其質量［8］。最后，將粗多糖溶解稀釋，測其吸光度。

1.2.2 多糖含量的測定 紫玉米粉多糖的含量采用苯酚硫酸法［9］。以葡萄糖標準溶液為標準品。建立的回歸方程為:y=0.0567x－0.0032(0～14μg/mL，R2=0.9998)，其中y表示吸光度，x表示葡萄糖濃度。多糖的得率(%)=粗提物中含有的多糖質量/最初紫玉米粉的質量×100。

1.2.3 選擇酶類型 選用果膠酶、纖維素酶、木瓜蛋白酶，采用單一加入［10］、混合加入和分步加入的組合方法［11］，在同一條件下對相同的樣液進行處理，得出最佳的酶組合。通過所購買的酶的說明介紹得知纖維素酶的適宜溫度為45～60℃，pH為4.0～5.5;果膠酶的適宜溫度為45～50℃，pH為3.0～6.0;木瓜蛋白酶的適宜溫度為60℃左右，pH為4.5～7.0。為了保證3種酶在實驗中的活性，綜合考慮它們的適宜條件，選擇50℃、pH5.0為酶解液的條件［12］。然后按照步驟1.2.1進行實驗。

1.2.4 酶法提取多糖 在3個樣液中分別加入3種不同的酶液各3mL來提取多糖;混合酶法提取紫玉米多糖:混合酶是由這3種酶各1mL混合，再加入到樣液中用來提取多糖;分步酶法提取多糖:1mL纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶依次加入同一個樣液進行處理來提取多糖［10］。

1.2.5 紫玉米提取工藝的優(yōu)化 在不同pH、酶解溫度、酶解時間、酶濃度［13］單因素實驗結果的基礎上，用Design－Expert 8.0軟件對其中重要的3個因素進行響應面分析，進一步優(yōu)化紫玉米多糖的提取工藝參數。各因素水平及編碼見表1所示。

表1 實驗因素水平及其編碼Table 1 Factors and levels of response surface experiment

2 結果與分析

2.1 酶種類的選擇

圖1為3種不同類型酶的單一提取法、混合提取法和分步提取法得出的紫玉米多糖的得率。由圖1看出，分步酶法具有一定的優(yōu)勢。因此，在后面的實驗中選擇用分步酶法來進行多糖的提取實驗。

2.2 分步酶組合提取紫玉米多糖的單因素實驗

2.2.1 不同pH對紫玉米多糖得率的影響 固定酶濃度0.03mg/mL、酶解溫度50℃、酶解時間2h［14］的條件下，分別采用不同的酶解 pH4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，按1.2.1操作，研究提取多糖的最適pH。結果見圖2。由圖2看出，紫玉米多糖的得率在pH5.5時最大，pH繼續(xù)增大得率反而下降，酶對pH的變化表現出很高的敏感度，如果酶反應的pH偏離了某個適宜范圍，活性就會降低。據此，選出的最適pH為5.5。

圖1 不同種類酶對紫玉米多糖得率的影響Fig.1 Yields rate of polysaccharide of using different enzymatic hydrolysis

圖2 pH與紫玉米多糖得率的關系Fig.2 Relationship of enzymatic hydrolysis of pH and the yield rate of polysaccharide

2.2.2 不同酶解溫度對紫玉米多糖得率的影響固定酶濃度為0.03mg/mL、pH5.5、酶解時間2h的條件下，分別采用不同的酶解溫度30、40、50、60、70、80℃，按1.2.1操作，研究提取多糖的最佳溫度。結果見圖3。由圖3看出，溫度在60℃時得率最大，而后隨著溫度的繼續(xù)升高，得率反而降低?？赡苁且驗闇囟瘸擞绊懛磻卸嗵堑慕鏊俣?，而且還影響著加入的酶的活性的大小。溫度升高，酶活性增加，促使多糖溶出。但是超過60℃后，酶活性可能會降低，繼續(xù)升高溫度，甚至會喪失活性，表現為得率降低。因此紫玉米多糖的最佳酶解溫度為60℃。

圖3 酶解溫度與紫玉米多糖得率的關系Fig.3 Relationship of temperature and the yield rate of polysaccharide

2.2.3 不同的酶解時間對紫玉米多糖得率的影響固定酶濃度0.03mg/mL、pH5.5、60℃的條件下，分別采用不同的酶解時間 1、2、3、4、5、6h 研究提取多糖的最佳時間。按1.2.1操作，由圖4看出，多糖的得率隨著酶解時間的延長呈現出上升的趨勢，當時間為3h時，得率最高，繼續(xù)延長時間，得率反而下降。分析原因，可能是酶的量在逐漸減少，不足以維持反應的進行。通過對實驗結果的分析，而且考慮到時間的效率和有限性，最后選擇3h為最佳酶解時間。

圖4 酶解時間與紫玉米多糖得率的關系Fig.4 Relationship of extraction time and the yield rate of polysaccharide

2.2.4 不同酶濃度對紫玉米多糖得率的影響 固定pH5.5、60℃、3h的提取條件，分別采用不同的酶濃度0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mg/mL，以確定最佳的酶濃度。按1.2.1操作，結果見圖5。由圖5看出，多糖得率在酶濃度為0.03mg/mL時最大，然后又出現回落趨勢。通過實驗結果，可得最佳酶濃度為0.03mg/mL。

圖5 酶濃度與紫玉米多糖得率的關系Fig.5 Relationship of enzyme dosage and the yield rate of polysaccharide

2.3 響應面優(yōu)化

2.3.1 響應面優(yōu)化設計結果 綜合上述的實驗結果，當最適酶濃度在0.03mg/mL附近時，它的變化對多糖的得率沒有引起太大的影響，因此選擇對多糖得率產生影響較大的pH、酶解溫度和酶解時間，進行響應面實驗設計。并應用軟件Design Expert 8.0來分析處理數據，實驗結果見表2。

利用Design－Expert 8.0軟件對該實驗結果進行響應面分析，通過回歸擬合，得到了pH(X1)、酶解溫度(X2)、酶解時間(X3)這3個因素與紫玉米多糖得率Y的回歸方程Y=8.42+0.41X1+0.23X2－0.37X3－0.39X1X2－0.045X1X3－0.45X2X3－1.55X12－對回歸模型進行方差分析結果見表3。由表3可知，回歸模型p＜0.0001，表示該模型高度顯著，可以用來進行響應值預測，而模型失擬項不顯著，證明該模型選擇合適。校正決定系數0.9614，表示該模型能解釋96.14%的響應值變化，相關系數R2=0.9831，說明該模型的擬合度良好，表明該模型是可行的，可以用來預測紫玉米多糖的得率。

表2 響應面設計方案與實驗結果Table 2 Response surface design and results

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Variance analysis of regression equation

因素X1(pH)對紫玉米多糖得率的影響的線性效應p＜0.01，是極顯著的，X3(酶解時間)產生的影響是顯著的，而X2(酶解溫度)不顯著。X1X2、X2X3對多糖得率的交互影響是顯著的，而X1X3不顯著，但的曲面效應都極顯著。說明各個因素與響應值之間沒有表現出簡單的線性關系?？梢杂蓡我蛩谾值的大小判斷各因素對多糖得率的影響順序。由此得出對多糖得率影響強弱的順序為pH＞酶解時間＞酶解溫度。

2.3.2 雙因素間的交互作用的分析 由表3可知:本實驗所建立的數學回歸模型中，在α=0.05水平上，X1與X2、X2與X3交互作用顯著，而X1與X3交互作用不顯著。依據實驗所取得的數據，作出X1與X2、X2與X3三維空間響應面圖，據此可分析和評價雙因素交互作用的影響，如圖6所示，其中的Y表示多糖得率。由圖6可以看出，時間一定時，pH與酶解溫度的交互作用比較顯著，當酶解時間在零水平上時，即3h時，隨著pH與酶解溫度的變大，得率顯著增加，之后呈下降趨勢，坡度較緩;當pH在零水平上時，即為5.5時，酶解溫度與酶解時間的交互作用表現顯著。響應值隨著酶解溫度和酶解時間的緩慢增加而增加，當達到最大值之后，多糖的得率反而隨著條件的增加而下降。經軟件分析酶法提取紫玉米多糖的最佳條件:pH5.62，酶解溫度60.10℃，酶解時間2.83h(約170min)，在此條件下，紫玉米多糖得率的理論值為8.47%。綜合實際操作，紫玉米多糖最佳提取條件為:pH5.5、酶解溫度 60℃、酶解時間170min，最后進行三次驗證多糖的實際得率為8.42%，與理論值的貼近度達99.41%。

圖6 不同因素交互作用對紫玉米多糖得率的影響Fig.6 Effect of interaction of different factors on polysaccharide content from purple corn

3 結論

實驗以紫玉米為原料，從酶組合、pH、酶解溫度、酶解時間、酶濃度這五個方面考慮多糖的得率。首先篩選出了分步法是最好的酶組合方法。在單因素實驗的基礎上，對提取參數采用響應面實驗進行分析優(yōu)化，所得結果為:紫玉米多糖最佳提取條件為pH5.5、酶解溫度60℃、酶解時間170min，最后進行三次驗證多糖的實際得率為8.42%，與理論值的貼近度達99.41%。由響應曲面和等高線圖可知，pH、酶解溫度、酶解時間對多糖得率的影響的強弱順序依次為pH＞酶解時間＞酶解溫度。

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