HPLC法同時測定小兒熱速清顆粒中綠原酸和黃芩苷的含量

史宏妍，潘成學(xué)（1.河南省中醫(yī)院，鄭州450003；2.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，鄭州450001）

小兒熱速清顆粒由黃芩、金銀花、柴胡、板藍根、葛根等多味中藥材組成，具有清熱解毒、瀉火利咽的功效[1]，對小兒急性呼吸道感染療效顯著[2]。黃芩是處方中的君藥，其有效成分黃芩苷具有多種生物活性，綠原酸是金銀花的主要有效成分，也是質(zhì)量控制的主要指標之一。為進一步完善該制劑的質(zhì)量控制方法，筆者采用高效液相色譜（HPLC）法同時測定該制劑中綠原酸和黃芩苷的含量，方法簡便易行，結(jié)果準確可靠，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

LC-10 A型HPLC儀，包括LC-10 ATVP泵，SPD-10 AVP紫外檢測器（日本SHIMADZU公司）；色譜工作站：HW-2000（南京千譜軟件有限公司）；BP211 D型1/10萬電子分析天平（德國Sartorius公司）。

綠原酸、黃芩苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-200413、110715-200514，供含量測定用）；小兒熱速清顆粒（哈爾濱圣泰制藥有限公司，批號：1104062、1105087、1106029，規(guī)格：每袋2 g）；甲醇為色譜純，水為高純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對照品和黃芩苷對照品適量，加甲醇溶解，超聲15 min，用甲醇分別制備成綠原酸濃度為0.15mg·mL－1和黃芩苷濃度為0.30mg·mL－1的溶液，作為對照品貯備液[3]。

2.1.2 供試品溶液的制備 取小兒熱速清顆粒10 g，研細，精密稱取約2 g，置于50 mL容量瓶中，加甲醇40 mL，超聲處理15min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液2 mL，置于10 mL容量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

2.1.3 陰性對照液的制備 按處方制備缺金銀花提取物、黃芩提取物的陰性樣品，按“2.1.2”項下方法處理，即得。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：DiamonsilTM-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水-磷酸（v/v＝52∶48∶0.1），pH：4.0；流速：1 mL·min－1；進樣量：10 μL；檢測波長：323 nm；柱溫：25℃。分別取對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液10 μL，注入色譜儀。理論板數(shù)以綠原酸、黃芩苷分別計算，應(yīng)不低于2400、4700。綠原酸、黃芩苷的拖尾因子分別為1.01、1.03，保留時間約為4.5、22.5 min；綠原酸、黃芩苷及與其他組分的分離度都＞1.6；陰性樣品不干擾樣品測定。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密量取一定量的綠原酸和黃芩苷對照品貯備液，加流動相稀釋成綠原酸濃度為1.50、8.5、15.00、22.50、30.00、35.50、40.00 μg·mL－1的溶液；黃芩苷濃度為0.5、5、25、50、75、100 μg·mL－1的溶液。按照“2.2”項下色譜條件依次進樣。以濃度（X，μg·mL－1）為橫坐標，峰面積積分值（Y）為縱坐標，制備標準曲線，得綠原酸回歸方程Y＝2081.51675 X+3.67132（r＝0.9996，n＝6）；得黃芩苷回歸方程Y＝25.142 X+1.3674（r＝0.9999，n＝6）。結(jié)果表明，綠原酸檢測濃度在1.50～40.00 μg·mL－1之間、黃芩苷檢測濃度在0.50～100.00 μg·mL－1之間與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

2.4 精密度試驗

分別精密吸取綠原酸和黃芩苷對照品貯備液適量，重復(fù)進樣6次，每次10 μL，按“2.2”項下色譜條件操作，測定峰面積[4]。結(jié)果，綠原酸RSD＝1.36%（n＝6），黃芩苷RSD＝0.94%（n＝6），表明儀器精密度較好。

2.5 重復(fù)性試驗

分別精密量取同一批樣品適量，共5份，分別按“2.1”項下方法制備供試品溶液，并進行色譜分析。結(jié)果，綠原酸RSD＝1.62%，黃芩苷RSD＝1.20%，表明方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

分別精密量取供試品溶液10μL，分別于0、1、2、4、6、8、12、24h進樣，測定。結(jié)果，綠原酸RSD＝1.53%，黃芩苷RSD＝0.38%，表明供試品溶液24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取同一批號樣品（批號：1104062）適量，共5份，加入相應(yīng)量的綠原酸和黃芩苷對照品，按“2.1.2”項下方法處理并測定，計算回收率。結(jié)果，綠原酸平均加樣回收率為99.22%，RSD＝1.45%；黃芩苷平均加樣回收率99.68%，RSD＝0.84%，詳見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝5）Tab 1 Results of recovery tests（n＝5）

2.8 樣品含量測定

取一定量3批樣品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，取10 μL進樣，按“2.1”項下方法分別測定樣品中綠原酸和黃芩苷的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Content determination of samples（n＝3）

3 討論

小兒熱速清顆粒中綠原酸和黃芩苷的含量各不相同，黃芩苷的測定與2005年版《中國藥典》方法進行比較[5]，兩種方法測定結(jié)果非常吻合，但該藥典方法只能單一測定黃芩苷的含量，不能同時測定黃芩苷和綠原酸的含量。為了保證其質(zhì)量，選擇一種簡便、快速、準確的定量方法控制其質(zhì)量是非常重要和必要的。

在流動相系統(tǒng)的選擇中，筆者曾以甲醇-水-磷酸、甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水-磷酸、乙腈-水-冰醋酸等不同體積分數(shù)、不同比例的流動相系統(tǒng)進行等度和梯度洗脫試驗。結(jié)果表明，用甲醇-水-磷酸（52∶48∶0.1）進行梯度洗脫為佳，峰形對稱且分離度較好，調(diào)整流動相不同時間洗脫比例之后，各峰的保留時間適中，且基線較平穩(wěn)，不易漂移，同時提高了色譜圖的分離度，有效避免了色譜圖的肩峰、拖尾現(xiàn)象等。

[1]國家藥典委員會.國家藥品標準新藥轉(zhuǎn)正標準（第38冊）[S].北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：38-21.

[2]徐新紅，王素翠，賈 曦.小兒熱速清顆粒的臨床治療與護理觀察[J].光明中醫(yī)，2008，23（8）：1201.

[3]李 堅，馮煥村，杜 璐.HPLC法測定銀黃含片中綠原酸和黃芩苷的含量[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報，2005，21（6）：683.

[4]張海珠，周 濃，李海峰，等.HPLC法測定小兒熱速清顆粒中黃芩苷的含量[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2009，5（8）：52.

[5]周 濃，王 胤，謝 靜，等.對2005年版《中國藥典》小兒熱速清口服液中含量測定方法的改進[J].中國藥房，2010，21（27）：2559.