羅漢果甜苷干預(yù)棕櫚酸致胰島B細胞氧化應(yīng)激相關(guān)損傷的機制研究Δ

陳善源，鄧立東，徐 勤，馮樂平，黃嵐珍，于冉冉（桂林醫(yī)學(xué)院，廣西桂林 541004）

羅漢果甜苷（Mogrosides）是一組含三萜苷元（羅漢果醇，Mogrol）和不同數(shù)目葡萄糖殘基的糖苷，為葫蘆科植物羅漢果（Siraitia grosvenorii）提取物的主要甜味成分[1]。羅漢果甜苷對四氧嘧啶復(fù)制的糖尿病模型動物有抗氧化和控制血糖水平的作用[2]，而對正常動物的血糖無顯著作用[3]。近年研究[4]提出胰島素抵抗導(dǎo)致的血糖血脂水平調(diào)節(jié)紊亂可使胰島B細胞處于持續(xù)的氧化應(yīng)激狀態(tài)，活化叉頭框蛋白-1（FOXO1）等轉(zhuǎn)錄因子，抑制葡萄糖代謝和胰島素合成，損害胰島素分泌功能并導(dǎo)致凋亡。羅漢果甜苷可能通過抗氧化作用保護胰島B細胞的胰島素分泌功能并控制糖尿病動物模型的血糖水平，但具體作用機制的研究尚未見文獻報道。本研究通過觀察羅漢果甜苷干預(yù)棕櫚酸導(dǎo)致的胰島B細胞氧化應(yīng)激損傷效應(yīng)，初步探討羅漢果甜苷通過抗氧化作用保護胰島B細胞的機制，為今后進一步闡明羅漢果甜苷的降血糖機制奠定堅實的理論基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SW-CJ-2F型超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；Galaxy 170 S型CO2細胞培養(yǎng)箱（德國Eppendorf公司）；FACSAriaⅢ流式細胞儀（美國BD公司）；Tprofessional PCR儀（德國Biometra公司）；DYY-6D型瓊脂糖電泳儀（北京六一儀器廠）；JS-780型凝膠成像儀（上海培清科技有限公司）。

1.2 試藥

羅漢果甜苷（桂林萊茵生物科技股份有限公司，其中羅漢果甜苷含量為50%）；棕櫚酸（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；低糖Dulbecco's改良Eagle's培養(yǎng)基（DMEM）培養(yǎng)液、高糖DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清（美國Thermo Scientific公司）；0.5%含乙二胺四乙酸（EDTA）、胰酶與D-Hank’s溶液（美國Invitrogen公司）；二氯熒光素雙酯（DCFH-DA）法活性氧檢測試劑盒、異硫氰酸熒光素（FITC）標記Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所）；超純RNA提取試劑盒、HiFi-MMLV逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒與2x Es Taq Mastermix PCR試劑盒（北京康為世紀生物技術(shù)有限公司）。

1.3 細胞

小鼠胰島B細胞系NIT-1細胞由桂林醫(yī)學(xué)院馮樂平教授研究組惠贈。

2 方法

2.1 NIT-1細胞培養(yǎng)與傳代

NIT-1細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清與抗生素（100 u·mL－1青霉素和100 μg·mL－1鏈霉素）的低糖DMEM培養(yǎng)液中，置37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。細胞占據(jù)培養(yǎng)瓶瓶底面積80%左右時以胰酶消化并離心收集細胞，計數(shù)后按每孔30萬細胞接種至六孔板，加培養(yǎng)液至每孔總液體量為2 mL。培養(yǎng)48 h，細胞占據(jù)50%～60%培養(yǎng)孔底面積后，按表1分組，為每組更換培養(yǎng)液，每組3個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后收集細胞進行試驗。各處理組培養(yǎng)液組成見表1。

表1 各處理組培養(yǎng)液組成Tab 1 Content of cultivate medium for each group

牛血清白蛋白溶液中牛血清白蛋白濃度為50 g·L－1。羅漢果甜苷溶液濃度按羅漢果甜苷的含量計算為40 mmol·L－1。棕櫚酸牛血清白蛋白溶液中棕櫚酸濃度為4 mmol·L－1，牛血清白蛋白濃度為50 g·L－1，溶劑均為高糖DMEM培養(yǎng)液。

各組培養(yǎng)環(huán)境中均含有9.375 g·L－1牛血清白蛋白；羅漢果甜苷對照組和干預(yù)組均含有1 mmol·L－1羅漢果甜苷；模型組和羅漢果甜苷干預(yù)組中均含有0.75 mmol·L－1棕櫚酸。

2.2 流式細胞術(shù)測定NIT-1細胞內(nèi)活性氧自由基（ROS）含量與凋亡率

細胞加藥處理完畢后，一部分加入適量無血清高糖DMEM培養(yǎng)液洗滌，每孔加入1 mL無血清高糖DMEM培養(yǎng)液與DCFH-DA工作液1 μL，混勻后置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，孵育完畢后洗滌，胰酶消化后制成細胞懸液；一部分制成細胞懸液后按FITC-Annexin V凋亡檢測試劑盒的操作說明對凋亡細胞進行標記。標本處理完畢后上流式細胞儀檢測。DCF熒光強度值即可看作判斷ROS含量高低的指標。

2.3 半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR測量細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運受體（GLUT）-2與丙酮酸激酶編碼基因相對表達水平

細胞加藥處理完畢后，以D-Hank’s平衡鹽液洗滌2次，按RNA抽提試劑盒說明操作，提取細胞中的總RNA。各樣本總RNA經(jīng)測量RNA濃度后，按照逆轉(zhuǎn)錄和PCR試劑盒說明操作，逆轉(zhuǎn)錄生成各樣本的cDNA片段，再對cDNA片段進行半定量PCR。PCR產(chǎn)物以最大電壓250 V、最大電流400 mA的參數(shù)在2%瓊脂糖凝膠中進行電泳，在凝膠成像儀中拍攝電泳條帶照片。PCR反應(yīng)所使用的引物序列見表2。

表2 PCR反應(yīng)所使用的引物序列Tab 2 Primer sequence for PCR assay

2.4 數(shù)據(jù)處理

流式細胞儀數(shù)據(jù)以FlowJo 7.6流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)分析軟件進行分析處理；半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR所得電泳灰度圖片以Gel-Pro Analyzer 4分析并獲取各條帶的積分光密度值（IOD），使用IOD在Excel中求得各樣本目的基因的相對表達強度（相對表達強度計算公式：相對表達強度＝目的基因條帶IOD/內(nèi)參基因條帶IOD）。上述數(shù)據(jù)匯入SPSS 11.0軟件中，使用單因素方差分析進行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 羅漢果甜苷對高脂環(huán)境中B細胞內(nèi)ROS含量的影響

與空白對照組比較，模型組NIT-1細胞內(nèi)的ROS含量顯著增加（P＜0.05）；羅漢果甜苷對照組細胞內(nèi)的ROS含量顯著減少（P＜0.05）。與模型組比較，羅漢果甜苷干預(yù)組NIT-1細胞內(nèi)的ROS含量顯著減少，表明羅漢果甜苷可顯著降低NIT-1細胞內(nèi)ROS含量，對棕櫚酸導(dǎo)致的NIT-1細胞內(nèi)ROS增加的抑制作用更為顯著。各組DCF熒光強度比較見表3。

表3 各組DCF熒光強度比較（±s，n＝3）Tab 3 Comparison of DCF fluorenscence strength in each group（±s，n＝3）

表3 各組DCF熒光強度比較（±s，n＝3）Tab 3 Comparison of DCF fluorenscence strength in each group（±s，n＝3）

與空白對照組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.blank control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

組別空白對照組羅漢果甜苷對照組模型組羅漢果甜苷干預(yù)組DCF熒光強度值190±5.20148±3.61＊490±8.33＊305±9.07＊#

3.2 羅漢果甜苷對高脂環(huán)境中B細胞糖代謝關(guān)鍵基因表達水平的影響

對各樣本總RNA的逆轉(zhuǎn)錄PCR均成功合成出PCR產(chǎn)物，分別為小鼠磷酸甘油醛脫氫酶編碼基因gapdh的315 bp產(chǎn)物、小鼠GLUT-2編碼基因slc2a2的174 bp產(chǎn)物和小鼠丙酮酸激酶編碼基因pklr的205 bp產(chǎn)物。

與空白對照組比較，羅漢果甜苷對照組slc2a2基因相對表達水平顯著降低（P＜0.05）；模型組slc2a2基因相對表達水平降低更顯著（P＜0.05），同時pklr基因相對表達水平也顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，羅漢果甜苷干預(yù)組上述指標均顯著增強（P＜0.05）。各組糖代謝關(guān)鍵基因表達水平的比較見表4；半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖見圖1。

表4 各組糖代謝關(guān)鍵基因表達水平的比較（±s，n＝5）Tab 4 Comparison of relative gene expression level of glucose metabolism in each grou（p±s，n＝5）

表4 各組糖代謝關(guān)鍵基因表達水平的比較（±s，n＝5）Tab 4 Comparison of relative gene expression level of glucose metabolism in each grou（p±s，n＝5）

與空白對照組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.blank control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

組別空白對照組羅漢果甜苷對照組模型組羅漢果甜苷干預(yù)組pklr基因相對表達水平10.87±0.160.18±0.06＊0.71±0.21＊#slc2a2基因相對表達水平10.67±0.23＊0.34±0.14＊0.87±0.15#

3.3 羅漢果甜苷對NIT-1細胞群落凋亡率的影響

流式細胞儀測定結(jié)果顯示，空白對照組已有5%左右的細胞自發(fā)凋亡，培養(yǎng)環(huán)境中存在1 mmol·L－1濃度的羅漢果甜苷對NIT-1細胞群落凋亡率無顯著影響（P＞0.05）。加入0.75 mmol·L－1的棕櫚酸后，細胞凋亡率顯著上升（P＜0.05），羅漢果甜苷對棕櫚酸所造成的凋亡增加并無顯著抑制作用（P＞0.05）。各組凋亡率比較見表5。

表5 各組凋亡率比較（±s，n＝3）Tab 5 Comparison of apoptosis percentage in each group（±s，n＝3）

表5 各組凋亡率比較（±s，n＝3）Tab 5 Comparison of apoptosis percentage in each group（±s，n＝3）

與空白對照組比較：＊P＜0.05vs.blank control group：＊P＜0.05

組別空白對照組羅漢果甜苷對照組模型組羅漢果甜苷干預(yù)組5.79±1.445.44±0.2412.80±3.83＊16.00±4.33＊凋亡率/%

圖1 半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig 1 Agarose gel electrophoresis of semi-quantitative RTPCR assay

4 討論

本研究以高糖培養(yǎng)基和棕櫚酸模擬機體胰島素抵抗所導(dǎo)致的高血脂和血糖代謝障礙產(chǎn)生的內(nèi)環(huán)境改變，結(jié)果顯示羅漢果甜苷可顯著降低在此環(huán)境中大幅上升的NIT-1細胞內(nèi)ROS含量，與文獻報道[5]相同。正常情況下細胞無法攝取完整的分子量達1287 Da的羅漢果甜苷分子，動物實驗顯示口服羅漢果甜苷后在血液中只能檢測到羅漢果醇等水解產(chǎn)物[5]。未水解的羅漢果甜苷能在NIT-1細胞內(nèi)產(chǎn)生抗氧化作用的機制可能是通過細胞表面存在的糖苷酶進行水解，小分子苷元進入細胞產(chǎn)生抗氧化作用。

1分子羅漢果甜苷完全水解后可產(chǎn)生5分子葡萄糖。相當于1 mmol·L－1羅漢果甜苷劑量的羅漢果甜苷混合物水解可生成遠大于5 mmol·L－1的葡萄糖。NIT-1細胞在22.5 mmol·L－1葡萄糖的環(huán)境中培養(yǎng)48 h已有近5%的凋亡率，并隨葡萄糖濃度同步上升[6]。本研究中，羅漢果甜苷對照組的培養(yǎng)環(huán)境葡萄糖濃度可能高達30 mmol·L－1，NIT-1細胞凋亡率與空白對照組無顯著差異，顯示羅漢果甜苷的抗氧化劑活性可保護NIT-1細胞免受高濃度葡萄糖導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷。

本研究中觀察到羅漢果甜苷可以有效清除棕櫚酸產(chǎn)生的ROS，但不能減少棕櫚酸造成的凋亡，甚至呈現(xiàn)增加趨勢，這可以用“糖脂毒性”（Glucolipotoxicity）理論[7]作出解釋。高于生理水平的葡萄糖和脂類對胰島B細胞有協(xié)同損傷作用，除了產(chǎn)能代謝帶來的氧自由基損害外，還有蛋白糖基化和脂肪酸旁路代謝產(chǎn)物的毒害作用[8]參與。羅漢果甜苷的抗氧化作用只能減緩ROS產(chǎn)生的損傷作用，對其他損傷機制產(chǎn)生的凋亡效應(yīng)在本研究中未見顯著影響，水解產(chǎn)生的葡萄糖和棕櫚酸產(chǎn)生協(xié)同毒害作用，使NIT-1細胞凋亡率呈上升趨勢。

半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果顯示，羅漢果甜苷能促進GLUT-2與丙酮酸激酶編碼基因的表達上升，對胰島B細胞的胰島素分泌功能起到了一定的保護作用。胰島B細胞表面的GLUT-2數(shù)目不受胰島素水平的影響，當血糖上升時，葡萄糖自由進入胰島B細胞內(nèi)，線粒體產(chǎn)生更多能量和ROS，促使含有胰島素的分泌顆粒移動至胞膜并融合、釋放胰島素[9]。棕櫚酸代謝產(chǎn)生的ROS可通過激活JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促使轉(zhuǎn)錄因子FOXO1向胞核內(nèi)遷移和活化[10]。在胰島B細胞中，F(xiàn)OXO1的活化可抑制磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶和GLUT-2等多種產(chǎn)能代謝相關(guān)酶的基因表達[11]，導(dǎo)致胰島B細胞不能對血糖變化產(chǎn)生有效反應(yīng)，進而影響胰島素分泌功能，這可能是胰島B細胞在高糖高脂環(huán)境下的自我保護機制。棕櫚酸導(dǎo)致NIT-1細胞GLUT-2和丙酮酸激酶編碼基因下調(diào)表達的效應(yīng)被羅漢果甜苷逆轉(zhuǎn)，表明羅漢果甜苷起到的抗氧化作用可降低NIT-1細胞氧化應(yīng)激水平，可能逆轉(zhuǎn)FOXO1的活化，有助于恢復(fù)胰島B細胞的正常葡萄糖代謝能力和葡萄糖刺激后胰島素分泌（GSIS）作用。

綜上所述，羅漢果甜苷可顯著減少NIT-1細胞內(nèi)因棕櫚酸代謝而上升的ROS含量，并提高被抑制的GLUT-2和丙酮酸激酶的基因表達水平。這些效應(yīng)可能由于羅漢果甜苷清除細胞內(nèi)ROS后使氧化應(yīng)激激活的FOXO1失活所致，具體作用機制尚待進一步研究。

此外，胰島B細胞氧化應(yīng)激損傷理論中的一個重要觀點是轉(zhuǎn)錄因子FOXO1活化和胰腺十二指腸同源性蛋白1（PDX1）失活，此論點已有試驗證據(jù)佐證[12]。PDX1失活可導(dǎo)致胰島素合成和胰島細胞再生分化能力下降[13]，羅漢果甜苷的抗氧化作用可能抑制FOXO1活化并使PDX1的活性恢復(fù)，保護胰島B細胞的胰島素合成功能和增生分化能力。羅漢果甜苷的三萜苷元結(jié)構(gòu)上與甾體激素的相似性亦可能與藥理作用相關(guān)。新近研究結(jié)果[14]證明此苷元有激活腺苷酸、活化蛋白激酶（AMPK）的作用，而腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）參與胰島B細胞的胰島素釋放過程和脂代謝相關(guān)蛋白的表達和活性的調(diào)節(jié)[15]。這些作用與本研究所發(fā)現(xiàn)的效應(yīng)之間有何相互作用均是深入研究羅漢果甜苷和其結(jié)構(gòu)相似分子對胰島B細胞保護作用機制的方向。

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