曲妥珠單抗與順鉑序貫聯(lián)合應(yīng)用對(duì)乳腺癌細(xì)胞抑制作用的研究

吳志勇，孫勝杰，焦順昌（解放軍總醫(yī)院腫瘤內(nèi)科， 北京 100853）

HER-2（human epidermal growth factor receptors-2）基因的過度表達(dá)是乳腺癌的重要預(yù)后不良因素。曲妥珠單抗（赫賽汀，trastuzumab）是以HER-2/neu蛋白為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的人源化單克隆抗體。大量研究表明，曲妥珠單抗可明顯提高化療對(duì)HER-2/neu過度表達(dá)乳腺癌的療效，并可廣泛應(yīng)用于治療的各個(gè)階段[1]。但是在聯(lián)合治療方案中，曲妥珠單抗的使用最佳時(shí)機(jī)仍有待明確，因此，我們?cè)O(shè)計(jì)了關(guān)于曲妥珠單抗聯(lián)合化療序貫方式研究的系列實(shí)驗(yàn)，已報(bào)道的曲妥珠單抗與多西他賽、吉西他濱的序貫聯(lián)合應(yīng)用的結(jié)果，與臨床應(yīng)用情況基本吻合[2-4]。本文旨在尋找曲妥珠單抗與順鉑聯(lián)合應(yīng)用的最佳序貫方式，并初步探討其機(jī)制，從而為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥品和試劑 MI/1640培養(yǎng)液（美國GIBCO公司）；胎牛血清（北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所）；MTT（美國AMRESCO公司）；順鉑（齊魯制藥）；曲妥珠單抗（上海羅氏制藥）。

1.1.2 主要設(shè)備 二氧化碳孵箱（美國Baxter）；96孔板（美國COSTOR3599）；酶標(biāo)儀（上海雷勃分析儀器有限公司，型號(hào)：Multiskan MK3353）；YKH2 Ⅱ型液體快速混合器（江西醫(yī)療器械廠）。

1.2 方法

人乳腺癌細(xì)胞珠MDA-MB453其Her-2/neu基因擴(kuò)增為陽性，由解放軍總醫(yī)院腫瘤內(nèi)科提供，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。

1.2.1 MTT 法測(cè)定藥物作用抑制率 將2.0×104個(gè)細(xì)胞接種于96 孔板（200 μL/孔），培養(yǎng)24 h；將藥物按照不同濃度加入，共培養(yǎng)60 h；加入5% MTT 20 μL/孔，4 h后加入DMSO 200 μL/孔，振蕩；用酶標(biāo)儀（波長492 nm） 測(cè)定OD 值，最后結(jié)果取均值，以未處理組作為對(duì)照組，按下列公式計(jì)算各組的抑制率:抑制率（%） = 1– （實(shí)驗(yàn)組OD492/ 對(duì)照組OD492）×100 %。

1.2.2 MTT法測(cè)定順鉑與曲妥珠單抗以不同序貫方式聯(lián)合應(yīng)用的抑制率 分別設(shè)立DDP前24 h應(yīng)用HER組、DDP前18 h應(yīng)用HER組、DDP前12 h應(yīng)用HER組、DDP前6 h應(yīng)用HER組、DDP+HER同時(shí)作用組、DDP后6 h應(yīng)用HER組、DDP后12 h應(yīng)用HER組、DDP后18 h應(yīng)用HER組、DDP后24 h應(yīng)用HER組序貫結(jié)合方式。將順鉑與曲妥珠單抗加入孔中。順鉑加入后培養(yǎng)60 h，MTT法測(cè)定各組的OD值，重復(fù)操作3次，取平均值，計(jì)算出實(shí)驗(yàn)組抑制率。

利用以下金氏公式計(jì)算參數(shù)Q判斷兩藥的合并用藥效應(yīng)：

其中，Ea代表HER的抑制率，Eb代表DDP的抑制率，E（a+b）為兩藥聯(lián)合應(yīng)用的抑制率，即實(shí)測(cè)合并效應(yīng)，分母 Ea+ Eb– Ea*Eb為期望合并效應(yīng)，Q 為兩者相比。Q 值在 0.85 ～ 1.15 時(shí)，合并效應(yīng)為相加作用，Q值＞ 1.15為協(xié)同作用，Q 值＜ 0.85 為拮抗作用[5]。

流式細(xì)胞儀分析DDP與HER以不同序貫方式聯(lián)合對(duì)MDA-MB453細(xì)胞細(xì)胞周期的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件，單因素方差分析比較各組，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，P ＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT 法測(cè)定藥物作用于MDA-MB453 細(xì)胞抑制率

通過計(jì)算得出DDP 30%抑制率濃度約為29.17 μg·mL-1。HER 15%抑制率約為7.19 μg·mL-1。

2.2 MTT 法測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組抑制率及Q值

結(jié)果見表1。結(jié)果表明兩藥聯(lián)合應(yīng)用時(shí)效果均好于單藥DDP組的抑制率（30.98%，P ＜ 0.01）；其中兩藥同時(shí)應(yīng)用組及加入DDP后應(yīng)用HER組聯(lián)合抑制率明顯高于在DDP前應(yīng)用HER組，Q值提示各組均為相加作用，其中以兩藥同時(shí)使用時(shí)相加作用效果最好（Q = 1.106）。

表1 不同序貫方式順鉑與曲妥珠單抗聯(lián)合對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制率. n = 9, ±sTab 1 Inhibition ratio of combined treatment of HER and DDP in different sequences to breast cancer cells. n = 9, ±s

表1 不同序貫方式順鉑與曲妥珠單抗聯(lián)合對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制率. n = 9, ±sTab 1 Inhibition ratio of combined treatment of HER and DDP in different sequences to breast cancer cells. n = 9, ±s

注：聯(lián)合作用組抑制率與單藥DDP抑制率間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, *P ＜ 0.01；兩藥同時(shí)應(yīng)用組Q值與其他組Q值間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，**P ＜ 0.01Note：the difference of inhibition ratio between HER+DDP and DDP was statistically significant, *P ＜ 0.01; Q-value difference between simultaneously combined group and other groups was statistically significant, **P ＜ 0.01

組別 HER抑制率/% HER + DDP抑制率/% Q值單藥DDP – 30.98±1.537 –加入DDP前24 h應(yīng)用HER 15.83±0.095 36.57±1.141* 0.872±0.012加入DDP前18 h應(yīng)用HER 17.58±0.291 39.71±1.192* 0.921±0.021加入DDP前12 h應(yīng)用HER 16.44±0.863 39.39±1.204* 0.930±0.062加入DDP前 6 h應(yīng)用HER 14.03±0.778 41.42±3.196* 1.018±0.055 DDP + HER同時(shí)應(yīng)用 20.46±1.298 49.88±1.531* 1.106±0.071**加入DDP后 6 h應(yīng)用HER 28.23±1.462 47.03±0.988* 0.932±0.060加入DDP后12 h應(yīng)用HER 26.61±1.353 48.04±1.386* 0.973±0.047加入DDP后18 h應(yīng)用HER 28.23±2.904 49.91±1.798* 0.988±0.103加入DDP后24 h應(yīng)用HER 28.71±2.481 50.80±1.675* 1.000±0.094

2.3 流式細(xì)胞儀分析順鉑與曲妥珠單抗以不同序貫方式聯(lián)合應(yīng)用對(duì)細(xì)胞周期的影響

結(jié)果見表2。結(jié)果表明，與單藥DDP化療組相比，DDP前應(yīng)用HER組G0/G1、S期細(xì)胞所占比例減少，G2/M期細(xì)胞增多，而其他組則未見明顯變化，提示此組中兩藥的相加作用較弱與細(xì)胞周期的影響有關(guān)。

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：曲妥珠單抗與順鉑聯(lián)合應(yīng)用抑制作用強(qiáng)于單藥順鉑，其機(jī)制在于：HER-2過度表達(dá)可降低腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，聯(lián)合使用曲妥珠單抗可引起HER-2蛋白的內(nèi)化，而減少表達(dá)，從而提高腫瘤細(xì)胞化療敏感性，而取得較好的抑制率[6-7]。此外，順鉑作用于細(xì)胞DNA引起損傷的啟動(dòng)自身保護(hù)機(jī)制─非常規(guī)DNA合成進(jìn)行DNA修復(fù)，Pietras RJ等[8]證明順鉑聯(lián)合使用曲妥珠單抗可明顯減少順鉑引起的非常規(guī)DNA合成，從而取得較好的治療效果。

表2 乳腺癌細(xì)胞經(jīng)曲妥珠單抗與順鉑處理后各細(xì)胞周期的變化.%，n = 3，±sTab 2 Changes of cell cycle of cancer cell with treatment of HER and DDP.%, n = 3, ±s

表2 乳腺癌細(xì)胞經(jīng)曲妥珠單抗與順鉑處理后各細(xì)胞周期的變化.%，n = 3，±sTab 2 Changes of cell cycle of cancer cell with treatment of HER and DDP.%, n = 3, ±s

注：聯(lián)合作用組細(xì)胞周期與單藥DDP進(jìn)行單因素方差分析,*P ＜ 0.01Note: one-factor analysis of variance of cell cycle between combined treatment group and DDP group, *P ＜ 0.01

組別 G0/G1 S G2/M對(duì)照組 56.27±0.87 30.69±1.43 13.04±0.65單藥DDP 51.85±2.52 26.09±2.11 22.05±0.72單藥HER 65.32±2.32 24.11±1.73 10.57±2.15加入DDP前12 h應(yīng)用HER 30.94±2.01* 21.64±1.34* 47.42±3.38*DDP+HER同時(shí)應(yīng)用 49.60±1.37 24.79±1.93 25.61±2.82加入DDP后6 h應(yīng)用HER 53.89±2.04 24.61±1.45 21.50±0.93

在兩藥不同序貫方式聯(lián)合應(yīng)用的對(duì)比中發(fā)現(xiàn)，順鉑前應(yīng)用曲妥珠單抗效果較差?？赡芤?yàn)轫樸K主要針對(duì)增殖活躍的細(xì)胞，而先使用曲妥珠單抗會(huì)使腫瘤細(xì)胞停止在G0/G1期而降低了腫瘤細(xì)胞的增殖活性，所以也在一定程度上降低了對(duì)細(xì)胞毒藥物的敏感性。細(xì)胞周期結(jié)果顯示：與單藥順鉑比較，先應(yīng)用曲妥珠單抗后應(yīng)用順鉑組出現(xiàn)了明顯的S、G2/M期阻滯，但對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用卻沒有明顯增高?？赡苁且?yàn)閼?yīng)用曲妥珠單抗后激活了一些通路增加S、G2/M期細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)而增強(qiáng)了細(xì)胞DNA修復(fù)[9]，降低了兩藥聯(lián)合的抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)再次證實(shí)了曲妥珠單抗與順鉑對(duì)于腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用及對(duì)細(xì)胞周期的影響。并得出了兩藥不同序貫方式聯(lián)合使用時(shí)，均表現(xiàn)為相加作用，其中同時(shí)應(yīng)用時(shí)效果最好，并利用流式細(xì)胞技術(shù)初步證明這種差異同細(xì)胞周期的變化有一定的關(guān)系。本次實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步的臨床應(yīng)用及研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但是不同的個(gè)體、細(xì)胞系及亞群是否具有相同規(guī)律，是否還涉及到其他機(jī)制，還有待進(jìn)一步的基礎(chǔ)及臨床研究。