參龍健腦膠囊質量標準的研究

白 林, 王 超

（1.解放軍總醫(yī)院藥品保障中心藥檢室，北京 100853；2.大理學院藥學院，云南 大理 671000）

參龍健腦膠囊是由人參、地龍、何首烏等藥材加工而成的制劑，具有補腎填精、益氣活血、健腦益智的功效，適于腦中風及中風后遺癥。為建立參龍健腦膠囊質量控制標準，選擇方中的主要藥味作為質量控制指標進行分析研究。本文采用薄層色譜法對該制劑中人參皂苷Rb1、Re、Rg1，淫羊藿苷，地龍進行鑒別，采用HPLC法對淫羊藿苷的含量測定方法進行研究，現(xiàn)將結果報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀（含自動脫氣機、四元梯度泵、DAD檢測和化學工作站）；超聲波清洗器（北京市天海雙龍醫(yī)療器械有限責任公司）。

人參皂苷Rb1（批號110704-200216），人參皂苷Re（批號0754-200216），人參皂苷Rg1（批號0703-200117），淫羊藿苷(批號110737-200414)，人參對照藥材（批號120917-200205），地龍對照藥材（批號120987-200405）均來自中國藥品生物制品檢定所。

參龍健腦膠囊（解放軍總醫(yī)院制備，批號080112、080115、080118）；硅膠G薄層板（100 mm×200 mm，青島市海化干燥劑廠）；乙腈為色譜純；甲醇、磷酸等其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 人參皂苷的鑒別 取本品10 g，加水5 mL攪勻潤濕后，加水飽和的正丁醇25 mL，超聲處理20 min，吸取上清液，分別加15、10 mL氨試液洗滌2次，上層提取液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。精密稱取人參皂苷Rb1、Re和Rg1對照品，分別加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為陽性對照品溶液。按處方比例，取缺人參的其他藥材，按參龍健腦膠囊制法制備，再按供試品溶液的制備方法制備，所得溶液作為陰性對照溶液。照薄層色譜法[1]實驗，分別吸取上述溶液各3 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水（13∶7∶2）下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，分別置日光及紫外燈（365 nm）下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色斑點，陰性對照此處無斑點，結果見圖1。

圖1 人參薄層色譜圖A – UV下TLC圖；B – vis下TLC圖；1 – 人參皂苷Rb1對照品；2– 人參皂苷Re對照品；3 – 人參皂苷Rg1對照品；4 – 人參藥材；5– 樣品；6-陰性對照Fig 1 LC of Radix Et Rhizoma GinsengA – under UV; B – under vis; 1 – reference substance of Ginsenoside Rb1; 2 – reference substance of Ginsenoside Re; 3 – reference substance of Ginsenoside Rg1; 4 – crude drug of Radix Et Rhizoma Ginseng; 5– sample; 6 – negative reference substance

2.1.2 淫羊藿苷的鑒別 按“2.1.1”項同法制備供試品溶液。精密稱取淫羊藿苷對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為陽性對照品溶液。按處方比例，取缺淫羊藿的其他藥材，按參龍健腦膠囊制法制備，再按供試品溶液的制備方法制備，所得溶液作為陰性對照溶液。照薄層色譜法[1]實驗，分別吸取上述溶液各5 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水（65 : 35 : 10）10 ℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同黃色熒光斑點，陰性對照此處無斑點，結果見圖2。

圖2 淫羊藿苷薄層色譜圖1 – 淫羊藿苷對照品； 2，3，4 – 供試品；5 – 陰性對照Fig 2 TLC of icariin1 – reference substance of icariin; 2,3,4 – samples; 5 – negative reference substance

2.1.3 地龍的鑒別 取本品2 g，加氯仿20 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液置水浴上蒸干，殘渣加氯仿1 mL使溶解，作為供試品溶液。取地龍對照藥材1 g，加氯仿20 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液置水浴上蒸干，殘渣加氯仿1 mL使溶解，作為對照藥材溶液。按處方比例，取缺地龍的其他藥材，按參龍健腦膠囊制法制備，再按供試品溶液的制備方法制備，所得溶液作為陰性對照溶液。吸取上述溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，照薄層色譜法[1]實驗，以甲苯-丙酮（9 : 1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同黃色熒光斑點，陰性對照無此斑點。結果見圖3。

圖3 地龍薄層色譜圖1 – 地龍對照藥材；2 – 地龍藥材；3 – 供試品；4 – 陰性對照Fig 3 TLC of Pheretima1 – reference crude drug of Pheretima; 2 – crude drug of Pheretima; 3– sample; 4 – negative reference substance

2.2 . 含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應性實驗 色譜柱Zorbax Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：乙腈-水-磷酸（30 : 70 : 0.025）。流速：1.0 mL·min-1；檢測波長270 nm；柱溫40 ℃；進樣量：10 μL。淫羊藿苷的保留時間約為11 min，分離度大于3.0，按淫羊藿苷峰計算，理論板數(shù)大于6000。

2.2.2 溶液的制備 （1）對照品溶液的制備：取淫羊藿苷對照品約0.01 g，精密稱定，置5 mL量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。再從中精密吸取0.5 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得（每1 mL含100 μg淫羊藿苷）。（2）供試品溶液的制備：取本品20粒，傾出內(nèi)容物，精密稱定，研細，取約1粒的量，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入稀乙醇20 mL，密塞稱重，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）處理30 min，放冷，再稱定重量，以稀乙醇補足損失量，搖勻，過0.2 μm的微孔濾膜，作為供試品溶液。（3）陰性對照溶液的制備：按處方比例，取缺淫羊藿的其他藥材，按參龍健腦膠囊制法制備，再按供試品溶液的制備方法制備,所得溶液作為陰性對照溶液。

2.2.3 專屬性實驗 在“2.2.1”色譜條件下，淫羊藿苷出峰時間在11 min左右，峰形良好，樣品中其他成分對測定無干擾。色譜圖見圖4。

圖4 淫羊藿苷色譜圖A – 對照品；B– 樣品；C– 陰性對照；1– 淫羊藿苷Fig 4 Chromatograms of icariinA – reference substance; B – sample; C – negative reference substance;1 – icariin

2.2.4 線性關系的考察 精密稱取淫羊藿苷對照品適量，以甲醇溶解稀釋，分別制得每1 mL含淫羊藿苷對照品10、20、40、80、160 μg的溶液，按上述色譜條件測定，以峰面積為縱坐標（Y），濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線，求出回歸方程為Y = 20.03X –0.532 0，r = 1.000，結果表明：淫羊藿苷在10 ～ 160 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關系。

2.2.5 精密度實驗 取“2.2.2”項下淫羊藿苷對照品溶液，按上述色譜條件，連續(xù)進樣6次，測定峰面積，RSD = 0.17%。

2.2.6 穩(wěn)定性實驗 取供試品溶液，按上述色譜條件分別于0、2、4、8、10 h后測定，RSD = 0.67%，結果表明供試品溶液中淫羊藿苷含量在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復性實驗 取樣品50粒，傾出內(nèi)容物，研細，混合均勻。精密稱取6份，每份約0.5 g。按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，依上述色譜條件測定含量，RSD = 1.48%。

2.2.8 回收率實驗 稱取“2.2.7”項下的細粉9份，每份約0.8 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，精密加入淫羊藿苷對照品甲醇溶液（高、中、低濃度）2 mL，按“2.2.2”項下方法制備所需供試品溶液，依上述色譜條件測定含量，結果平均回收率為99.5%，RSD =0.96%。具體結果見表1。

表1 加樣回收率實驗結果. n = 9Tab 1 Analysis of recovery. n = 9

2.2.9 樣品含量測定 取不同批次的參龍健腦膠囊，每批樣品測定3份，按供試品溶液的制備方法制備，在選定的色譜條件下測定并計算，結果含量為每粒含淫羊藿苷0.862 8 mg，RSD = 0.02%，具體見表2。

2.3 甲醇浸出物的檢查

取供試品約4 g，精密稱定，置250 mL錐形瓶中，精密加甲醇100 mL，密塞，稱定重量，靜置1 h后，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1 h，放冷后，取下錐形瓶，密塞，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用干燥濾器過濾，精密量取濾液25mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于150 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定，以干燥樣品量計算浸出物不得少于20%。

表2 淫羊藿苷含量測定結果Tab 2 Contents of icariin in samples

3 討論

采用薄層色譜法鑒別人參，用氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）10 ℃以下放置的下層溶液為展開劑展開效果不佳，而以氯仿-甲醇-水（13∶7∶2）混合后放置的下層溶液為展開劑分離效果較好。

淫羊藿苷是小檗科淫羊藿屬植物中的主要成分，具有免疫調節(jié)、抗腫瘤、影響內(nèi)分泌和心血管系統(tǒng)等多種重要的生物活性[2-5]。用HPLC法測定淫羊藿苷含量，用乙腈-水（30∶70）作流動相[6]，本品的基線不穩(wěn)定，而以乙腈-水-磷酸（30∶70∶0.025）作流動相基線穩(wěn)定。對淫羊藿苷對照品在紫外分光光度儀上進行全波長掃描，結果在270 nm處有最大吸收，與文獻[7]報道一致。

通過對3批樣品淫羊藿苷的測定，本品每粒含淫羊藿苷均在0.86 mg以上。故暫定本品每粒含淫羊藿以淫羊藿苷（C33H40O15）計，不得少于0.70 mg。

本實驗建立的TLC色譜系統(tǒng)，具有較好的分離效果，經(jīng)陰性樣品（缺人參、地龍及淫羊藿）實驗及樣品陽性實驗證明，處方其他組分無干擾，鑒別實驗成立。采用HPLC法測定淫羊藿中淫羊藿苷的含量，方法簡便、結果準確、靈敏度高，整個測試在13 min可以完成，可作為參龍健腦膠囊的質量控制方法。