超高液相色譜法測(cè)定食品中甲醛含量

方桂紅，徐莉，紀(jì)少凡

（1.海南醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，海南 海口 570101；2.海南省出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，海南 ?？?570311）

甲醛是一種重要的化工原料和有機(jī)溶劑，用途廣泛。常用于有機(jī)合成、合成材料、涂料、橡膠、農(nóng)藥等行業(yè)，也可用作消毒、防腐和熏蒸劑。由于甲醛不僅對(duì)人體的嗅覺、呼吸道產(chǎn)生極大的刺激性和毒性作用，還具有潛在的致癌作用。美國環(huán)保局已證實(shí)甲醛是人類的一種致癌物質(zhì)。因此，國家衛(wèi)生部明確規(guī)定禁止使用甲醛或甲醛化合物作為食品添加劑使用。食品中甲醛的來源，一方面是食品生產(chǎn)原料自身含有的細(xì)胞代謝中間產(chǎn)物—“天然”甲醛，其含量因食品種類不同而有所差異。另一方面則是人為造成甲醛的污染：啤酒生產(chǎn)過程中添加甲醛以提高其穩(wěn)定性，非法用于水產(chǎn)品以及其它干貨產(chǎn)品的保鮮和防腐以及食品包裝材料中甲醛殘留對(duì)食品的污染，除此之外還有用含有甲醛的飼料喂養(yǎng)動(dòng)物所造成甲醛在食品中的殘留。這些污染已經(jīng)嚴(yán)重?fù)p害了人類的健康，所以對(duì)食品中甲醛含量的檢測(cè)是不容忽視的。

目前，食品中甲醛的分析方法已經(jīng)很多，不同的食品種類處理方法也各不相同。常用的檢測(cè)手段是分光光光度法、電化學(xué)和色譜法。分光光度法雖然操作簡單，但容易產(chǎn)生假陽性。電化學(xué)方法操作繁瑣，效率低。氣相色譜法重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性不夠好[1]。因此，本法基于甲醛溶于水的特點(diǎn)，采用水蒸氣蒸餾后衍生化測(cè)定。該法無需對(duì)樣品進(jìn)行除蛋白等前處理，具有操作簡便，靈敏度高，重現(xiàn)性好，衍生化后可直接進(jìn)樣等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)際樣品分析中可以得到較好的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

乙腈（GR）：TEDIA 公司；磷酸（AR）、濃鹽酸（AR）：廣州化學(xué)試劑廠；甲醛標(biāo)準(zhǔn)品（37%）：SUPELCO公司。

UPLC液相色譜儀：美國Waters公司；A11型研磨機(jī)：德國IKA公司；2200 kjeltec自動(dòng)蒸餾裝置：美國FOSS公司；HWT-108水浴鍋：天津恒奧技術(shù)發(fā)展有限公司；實(shí)驗(yàn)室用水均為哇哈哈純凈水。

1.2 溶液配制

2，4-二硝基苯肼：稱取100 mg 2，4-二硝基苯肼溶解于24 mL鹽酸中，加水定容至100 mL。

磷酸溶液：100mL磷酸中加入900mL水中，混勻。

1.3 色譜條件

色譜柱：AcquityUPLCBEHC18柱（100mm×2.1mm×1.7μm）；柱溫：40℃；流動(dòng)相：乙腈-0.1%甲酸水（35+65）；流速：0.3 mL/min；紫外檢測(cè)器波長：365 nm；進(jìn)樣量：10μL。

1.4 樣品前處理方法

1.4.1 樣品的提取

將適量樣品用研磨機(jī)搗碎，稱取勻漿樣品10.0 g（精確至0.01 g）于凱氏瓶中，準(zhǔn)確加入20 mL蒸餾水，用玻璃棒攪拌均勻，浸泡30 min，加入10 mL磷酸溶液，水蒸氣蒸餾約2 min，用已盛有20 mL水的比色管收集蒸餾液至100 mL，同時(shí)做空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 衍生化反應(yīng)

取蒸餾液5.0 mL，置于10 mL具塞比色管中，加入2mL2，4-二硝基苯肼和3mL乙腈，置60℃水浴20min，流水中快速冷卻，直接吸取樣液進(jìn)行液相分析測(cè)定。

1.5 測(cè)定

1.5.1 甲醛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（3.33 mg/mL）的配制

吸取0.9 mL含量為37%甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液于100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，為甲醛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，冷藏保存。

1.5.2 甲醛標(biāo)準(zhǔn)工作液（100μg/mL）的配制

根據(jù)甲醛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的濃度，精密吸取適量于25 mL容量瓶中，加水至刻度，配置甲醛標(biāo)準(zhǔn)工作液，混勻備用，此液當(dāng)日配置。

1.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取 100μg/mL 的甲醛工作液 0.0、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32 mL 于 20 mL 具塞比色管中，加蒸餾水至5.0 mL，按衍生化步驟操作，最后進(jìn)行UPLC分析，然后以峰面積為縱坐標(biāo)，甲醛的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件的選擇

查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，常見樣品前處理手段主要采用直接加水振蕩或超聲提取、加入亞鐵氰化鉀等蛋白沉淀以及衍生化后反萃取[2-3]這3種方法。因此本文分別將上述3種方法和水蒸氣蒸餾裝置進(jìn)行前處理比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明直接加水提取回收率較高但由于沒有經(jīng)過凈化處理導(dǎo)致衍生化后樣液污染檢測(cè)系統(tǒng)，無法直接進(jìn)樣；在分光光度法中常用蛋白沉淀劑作為前處理方法，但測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定性差，精密度和靈敏度低，易產(chǎn)生假陽性；衍生化后用氯仿反萃取的方法雖提高靈敏度，可回收率不穩(wěn)定，操作繁瑣，耗時(shí)長，并且氯仿毒性大；然而本實(shí)驗(yàn)選用酸介質(zhì)下水蒸氣蒸餾，不僅可以避免直接蒸餾造成樣品乳化現(xiàn)象的產(chǎn)生，可應(yīng)用于各種基質(zhì)，而且收集液澄清衍生化后直接進(jìn)樣分析，出峰效果好，無干擾峰，大大提高了檢測(cè)的靈敏度。

考慮到蒸餾時(shí)間和酸介質(zhì)對(duì)甲醛的回收率可能會(huì)造成影響，因此本文分別選取不同的蒸餾時(shí)間和磷酸溶液的添加量進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示蒸餾時(shí)間小于1 min時(shí)，檢測(cè)限添加回收很難達(dá)到要求，可能是由于時(shí)間過短導(dǎo)致提取不完全，而蒸餾時(shí)間大于3 min時(shí)，回收率趨于穩(wěn)定但蒸餾液過量降低了該方法的檢測(cè)靈敏度，如圖1所示，所以本文選取蒸餾時(shí)間約2min提取液100 mL。對(duì)于磷酸溶液添加量的確定，在查看相關(guān)文獻(xiàn)基礎(chǔ)上分別加入不同量進(jìn)行蒸餾，結(jié)果表明加入量為10 mL時(shí)回收率能達(dá)到理想的效果，如圖2所示。

圖1 不同蒸餾時(shí)間對(duì)回收率的影響Fig.1 The different distillation time to influence the recoveries

圖2 不同磷酸溶液對(duì)回收率的影響Fig.2 The different phosphoric acid solution to influence the recoveries

2.2 測(cè)定條件的選擇

實(shí)驗(yàn)過程中分別嘗試使用Acquity UPLC BEH C18柱長為5 cm和10 cm兩種色譜柱進(jìn)行等度洗脫。分析測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)短柱在使用時(shí)具有局限性，加大乙腈的比例，出峰時(shí)間過快導(dǎo)致與溶劑峰分不開，降低乙腈比例雖延長了出峰時(shí)間但較低濃度時(shí)易產(chǎn)生分裂峰，峰型不尖銳，無法定性定量，然而長柱出峰好且能通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相有效的排除干擾峰。因此10 cm柱的分離效果優(yōu)于5 cm柱。在等度洗脫條件下，調(diào)節(jié)的乙腈-0.1%甲酸水溶液的比例發(fā)現(xiàn)兩種溶液的配比為35∶65時(shí)效果最佳，加入甲酸的流動(dòng)相使得峰型窄響應(yīng)高，保留時(shí)間約為6 min，若加大乙腈的比例保留時(shí)間縮短但會(huì)導(dǎo)致峰拖尾。

根據(jù)文獻(xiàn)資料，甲醛－2，4－二硝基苯腙的最大吸收波長分別在348、350、365 nm處，于是本文選擇后兩種波長進(jìn)行分析檢測(cè)并無明顯差異，如圖3、圖4所示，因此最終確定紫外檢測(cè)波長為365 nm。

圖3 波長為350 nm測(cè)定的甲醛標(biāo)準(zhǔn)譜圖Fig.3 The formaldehyde chromatogram in wavelength 350 nm

圖4 波長為365 nm測(cè)定的甲醛標(biāo)準(zhǔn)譜圖Fig.4 The formaldehyde chromatogram in wavelength 365 nm

2.3 線性關(guān)系及儀器檢出限

根據(jù)1.5.3項(xiàng)下測(cè)定結(jié)果，得回歸方程為Y=12068.1X+1337041；相關(guān)系數(shù)為0.9995。

結(jié)果表明，甲醛在0.050 mg/L～3.2 mg/L與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，儀器的最小檢出限（S/N=3）為0.050 mg/L。

2.4 不同樣品加標(biāo)回收和精密度實(shí)驗(yàn)

在選定的色譜條件下，對(duì)羅非魚、魚干、啤酒、腐竹和香菇五種樣品進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，按照1.4樣品前處理要求處理好樣品待檢。對(duì)樣品連續(xù)分析6次，5種樣品加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

圖5 線性關(guān)系考察Fig.5 Relationship between UPLC peak and formaldehyde concentration

表1 樣品加標(biāo)回收和精密度實(shí)驗(yàn)（n=6）Table 1 The spiked recoveries and precision of sample

實(shí)驗(yàn)表明在選定的色譜條件下進(jìn)樣分析，甲醛的重現(xiàn)性好，精密度高，準(zhǔn)確度好，樣品回收率在80.5%～105.2%。

3 結(jié)論

本文選用磷酸溶液中水蒸氣蒸餾法測(cè)定食品中甲醛的含量，相比于其它采用蛋白沉淀劑和直接提取的前處理方法應(yīng)用范圍廣，適合于各種樣品的分析，大大減少了基體對(duì)檢測(cè)物質(zhì)出峰的干擾，操作簡便、快捷，避免使用有毒有害試劑。并且該方法還能有效的提高了甲醛的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性，降低假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，適用于食品中甲醛含量的測(cè)定。

[1]黎永艷,李必斌,張海霞,等.食品中甲醛的檢驗(yàn)方法初探[J].廣西預(yù)防醫(yī)學(xué),2006(1):54-55

[2]納文娟,劉慧燕,方海田.食品中甲醛殘留量檢測(cè)方法的比較[J].保鮮與加工,2008,8(2):42-44

[3]彭科懷,陳江,趙年華,等.高效液相色譜法測(cè)定甲醛的研究[J].西南民族學(xué)院學(xué)報(bào),2000,26(2):159-162