酸奶中乳酸菌的分離及發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)測定

張 晶

(三門峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生化工程系，河南 三門峽 472000)

酸奶中乳酸菌的分離及發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)測定

張 晶

(三門峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生化工程系，河南 三門峽 472000)

利用MRS瓊脂培養(yǎng)基對酸奶中的乳酸菌進(jìn)行分離，共分離出A1、S2兩株乳酸菌。對兩株菌在牛奶中的發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行研究，結(jié)果表明：兩株菌均有較強(qiáng)的酸度、乙醛和丁二酮生成能力。

乳酸菌；發(fā)酵；酸度；乙醛；丁二酮

酸奶是一種傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，具有豐富的營養(yǎng)價值和良好的保健功能，作為發(fā)酵劑使用的乳酸菌，通常為保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌。

目前三門峽地區(qū)市售發(fā)酵酸奶主要采用傳統(tǒng)的菌種活化復(fù)壯進(jìn)行生成，營養(yǎng)較為豐富，但菌種質(zhì)量不易控制，長時間保存后容易出現(xiàn)過酸的現(xiàn)象，因此，了解發(fā)酵所用乳酸菌的菌種特性及發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)特征對于酸奶的品質(zhì)控制及發(fā)酵后熟階段的儲藏和食用有重要指導(dǎo)意義，同時，三門峽地區(qū)乳品消費(fèi)較全省乃至全國，仍處于中下水平，區(qū)域奶業(yè)發(fā)展薄弱，本研究將有助于地方乳品產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

1材料方法

1.1供試樣品。

本項(xiàng)目供試樣品為三門峽本地凝固型發(fā)酵酸奶品牌三隆和阿姆斯。于2011年9月16日分別購買兩品牌當(dāng)日生產(chǎn)批次產(chǎn)品用于項(xiàng)目研究。

1.2儀器試劑。

設(shè)備：超凈工作臺，生化培養(yǎng)箱，電子天平，酸度計(jì)，電子顯微鏡。

培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基[1]所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.3試驗(yàn)方法。

1.3.1乳酸菌分離。

采用平板菌落計(jì)數(shù)法，以原樣、10-1、10-2三個梯度進(jìn)行平板涂布，分離酸奶中的乳酸菌。

1.3.2乳酸菌理化鑒定。

菌落形態(tài)：觀察MRS培養(yǎng)基表面菌體生長狀況。

生化特征：將純化后的菌株進(jìn)行相關(guān)生化指標(biāo)檢測，具體方法參照文獻(xiàn)。[2,3]

1.3.3乳酸菌發(fā)酵性能測定。

將分離到的乳酸菌菌株接種至經(jīng)巴士消毒的復(fù)原乳中，在42℃下發(fā)酵至出現(xiàn)凝乳狀態(tài)，測定發(fā)酵過程中發(fā)酵液的酸度、丁二酮濃度和乙醛含量，具體測定方法參照文獻(xiàn)。[4-6]

2結(jié)果與討論

2.1乳酸菌分離。

在MRS瓊脂培養(yǎng)基上，原樣、10-1、10-2三個梯度培養(yǎng)皿中，阿姆斯樣品僅原樣中有菌落生長，菌體數(shù)目少且形態(tài)單一，三隆樣品在三個梯度中均有分布，菌落形態(tài)多樣。經(jīng)平板涂布和平板劃線分離后，結(jié)合顯微鏡觀察及革蘭氏染色結(jié)果，共篩得A1、S1、S2三株乳酸菌，其中A1由阿姆斯酸奶中篩得,S1、S2分離自三隆酸奶，具體形態(tài)見表1。

表1 乳酸菌菌落形態(tài)

鏡檢形態(tài)革蘭氏染色顯示，所分離的三株菌中，A1為革蘭氏陽性菌，鏈球狀；S1為革蘭氏陰性菌，鏈球狀；S2為革蘭氏陽性菌，桿狀；具體染色結(jié)果見圖1。乳酸菌是一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細(xì)菌，因此，所分離到的三株菌中，A1、S2為目標(biāo)菌株，而S1由于染色結(jié)果不符合乳酸菌特征，不再進(jìn)行后期發(fā)酵。將A1、S2純化后，以試管斜面保藏于4℃。

圖1 乳酸菌革蘭氏染色圖

2.2理化鑒定。

乳酸菌是一類發(fā)酵糖類不產(chǎn)H2S、H2O2，葡聚糖、硝酸鹽、吲哚實(shí)驗(yàn)均成陰性，甲基紅實(shí)驗(yàn)陽性，精氨酸反應(yīng)不產(chǎn)氨的細(xì)菌。[2]本研究依據(jù)上述理化特征，對所分離到的兩株菌進(jìn)行各種理化鑒定，結(jié)果見表2。

表2 理化鑒定結(jié)果

注：“++”表示陽性結(jié)果，“+”表示弱陽性結(jié)果，“—”表示陰性結(jié)果。

理化鑒定結(jié)果顯示：葡聚糖產(chǎn)生試驗(yàn)中，A1有較弱的陽性結(jié)果，S2為陰性；兩株菌在需氧量測定中，A1液體培養(yǎng)基中菌體主要沉淀在試管底部，可以判定為厭氧微生物，S2液體培養(yǎng)過程中菌體在試管中均勻分布，可以判定為兼性厭氧微生物；其他理化特征兩者一致。根據(jù)理化鑒定結(jié)果結(jié)合《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》，初步鑒定菌株A1為鏈球菌屬，菌株S2為德氏乳桿菌。

2.3發(fā)酵性能測定。

乳酸菌發(fā)酵分為兩個階段，第一階段為發(fā)酵產(chǎn)酸階段，在42℃下進(jìn)行乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸，當(dāng)酸度pH達(dá)到4.5時，酸奶中的酪蛋白變性沉淀析出，出現(xiàn)凝固結(jié)塊現(xiàn)象，第二階段為后酸化階段，主要是在4℃下保存?zhèn)溆茫M(jìn)行后熟作用。

2.3.1產(chǎn)酸特性。

將所分離到的兩株菌A1、S2接入經(jīng)巴氏消毒牛乳中，充分活化2-3次使菌株活力最大，按照2%的接種量接入100ml經(jīng)110℃20min滅菌的牛乳中，42℃恒溫發(fā)酵4-8h，每隔2h無菌取樣測定其酸度，以滴定度OT表示。測定結(jié)果見圖2。

圖2 發(fā)酵過程酸度變化

從圖2可知，兩株乳酸菌的酸度值在18-120OT之間，發(fā)酵產(chǎn)酸能力上，2h時A1的滴定度為18OT，S2達(dá)到22OT；發(fā)酵至6h時，A1的滴定度上升到98OT，S2為110OT，到8h接近發(fā)酵結(jié)束時，A1的滴定度為108OT，S2為120OT，整個發(fā)酵過程中，S2菌株的發(fā)酵產(chǎn)酸能力始終高于A1菌株，且在S2發(fā)酵液中先出現(xiàn)了凝固結(jié)塊現(xiàn)象，這與酸度測定結(jié)果一致。研究表明：乳桿菌的發(fā)酵產(chǎn)酸能力要高于嗜熱鏈球菌菌株，[5]本次分離到的兩株菌中，初步判定A1為鏈球菌屬，S2為德氏乳桿菌，該結(jié)果與相關(guān)研究結(jié)果一致。

2.3.2乙醛含量。

乙醛是在酸奶制作過程中由保加利亞乳桿菌產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)之一，pH值降到5.0時開始產(chǎn)生乙醛，在pH值為5.5-4.5之間生成加快，pH值為4.30-4.40時產(chǎn)生速度最大。之后生成量逐漸減少，pH值為4.2時乙醛含量幾乎不再產(chǎn)生。[7]發(fā)酵第二階段為風(fēng)味物質(zhì)的積累階段，因此本研究主要對該階段的乙醛含量進(jìn)行測定，具體結(jié)果見表3。

表3 后酸化階段乙醛含量(mg/L)

結(jié)果顯示：A1、S2兩株菌均有較強(qiáng)的產(chǎn)乙醛能力，隨著后熟時間的延長，乙醛含量逐漸增加，A1菌株發(fā)酵產(chǎn)物中乙醛含量在7.41-10.01mg/L之間，S2菌株發(fā)酵產(chǎn)物中乙醛含量在9.43-16.44mg/L之間。而乙醛生成量在一定范圍內(nèi)與酸度成正比，酸度越大產(chǎn)量越大。A1的產(chǎn)酸能力要弱于S2菌株，這與酸度測定結(jié)果一致。另有研究表明：乳酸菌產(chǎn)乙醛能力與菌體內(nèi)蘇氨酸醛縮酶有關(guān)，[8]通常乳桿菌內(nèi)蘇氨酸醛縮酶活性較高，[5]S2菌株為德氏乳桿菌，符合乙醛高產(chǎn)菌特征。

2.3.3丁二酮含量。

丁二酮又名雙乙酰，呈奶油香味，發(fā)酵乳中丁二酮含量的積累可增加產(chǎn)品的香味。

王偉軍等發(fā)現(xiàn)[9]:發(fā)酵第一階段有一定量的丁二酮累計(jì)，隨著發(fā)酵時間的延長，雙乙酰含量逐漸增加，在較低溫度下積累地更快，因此發(fā)酵乳中的丁二酮主要來源于后酸化階段，本研究對發(fā)酵第二階段中的丁二酮含量進(jìn)行測定，具體測定結(jié)果見表4。

表4 后酸化階段丁二酮含量(mg/L)

結(jié)果顯示：A1、S2兩株菌均有較強(qiáng)的丁二酮生成能力，隨著后熟時間的延長，丁二酮含量逐漸增加，A1菌株發(fā)酵產(chǎn)物中丁二酮含量在21.54-39.41mg/L之間，S2菌株發(fā)酵產(chǎn)物中丁二酮含量在8.35-18.51mg/L之間。研究表明：產(chǎn)丁二酮能力與原料奶中檸檬酸鹽含量有關(guān)，[8]通常球菌產(chǎn)丁二酮能力較強(qiáng)，[5]A1菌株為鏈球菌屬，符合丁二酮高產(chǎn)菌特征。

3結(jié)論

(1)利用MRS瓊脂培養(yǎng)基對兩種本地品牌酸乳中的乳酸菌進(jìn)行分離，初步確定A1、S2兩株菌為目的乳酸菌，其中A1在分類上屬于鏈球菌屬,S2分類地位與德氏乳桿菌相近。

(2)兩株菌的發(fā)酵特性研究表明，A1、S2兩株菌均有較強(qiáng)的酸度、乙醛和丁二酮生成能力，其中A1菌株在發(fā)酵產(chǎn)酸階段產(chǎn)酸能力弱于S2菌株，但在后酸化階段A1的丁二酮生成能力高于S2；S2的乙醛生成能力高于A1菌株。

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ClassNo.:TS252.54DocumentMark：A

(責(zé)任編輯：宋瑞斌)

StudiesontheIsolationandFermentationCharacteristicsofLacticacidbacteriainYogurt

Zhang Jing

In this paper,two lactic acid bacteria strains A1, S2 were isolated from the yogurt by the use of MRS agar media. The fermentation characteristics of isolated lactic acid bacteria were analyzed in milk. Results revealed that two strains had high pH, aldehydes and diacetyls production.

lactic acid bacteria; fermentation; pH; aldehyde; diacetyl

張晶，碩士，助教，三門峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院。研究方向：食品微生物。

1672-6758(2012)09-0073-2

TS252.54

A