RP-HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地不同部位貫葉金絲桃中金絲桃苷的含量Δ

李卓恒，孟德勝，盧來(lái)春，周 薇，于彩平，藕順龍，吳 畏

（第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院/野戰(zhàn)外科研究所藥劑科，重慶 400042）

RP-HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地不同部位貫葉金絲桃中金絲桃苷的含量Δ

李卓恒＊，孟德勝，盧來(lái)春，周 薇，于彩平，藕順龍，吳 畏#

（第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院/野戰(zhàn)外科研究所藥劑科，重慶 400042）

目的：建立測(cè)定貫葉金絲桃中金絲桃苷含量的方法，并測(cè)定不同產(chǎn)地不同部位貫葉金絲桃中金絲桃苷的含量。方法：采用反相高效液相色譜法。色譜柱為Boston Breeze-C18（250 mm×4.6 mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水溶液（40∶60，V/V），檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm，流速為1.0 mL·min－1。結(jié)果：金絲桃苷進(jìn)樣濃度在0.14～2.80μg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系（r＝0.999 4），平均加樣回收率為95.97%，RSD＝1.16%（n＝6）。四川產(chǎn)地貫葉金絲桃花、葉中的金絲桃苷含量最高。結(jié)論：本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于貫葉金絲桃的質(zhì)量控制。

貫葉金絲桃；金絲桃苷；反相高效液相色譜法；含量測(cè)定；產(chǎn)地

貫葉金絲桃（Hypericum performatum L.）為藤黃科金絲桃屬多年生草本植物，其味苦、辛，性平，可清心明目、調(diào)經(jīng)活血、止血生肌、解毒消炎[1]，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)將其用于治療感染、婦科疾病、痛癤腫毒等皮膚疾病，療效較好。金絲桃苷是該藥材的主要活性成分之一?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明[2]，金絲桃苷具有抗炎、解痙、利尿、止咳、降血壓、降低膽固醇、抗腫瘤、預(yù)防糖尿病等作用，具有很大的新藥研發(fā)價(jià)值。目前，金絲桃苷主要從植物中提取，很多植物中都能提取出金絲桃苷，如：貫葉金絲桃（H.perforatum L.）、紅旱蓮（H.ascyron L.）、黑木相思樹(shù)（Acacia melanoxylon R.Br）等，其中貫葉金絲桃中金絲桃苷的含量最高，可達(dá)1.257%。但是，不同產(chǎn)地貫葉金絲桃中所能提取出的金絲桃苷含量不同。為對(duì)不同產(chǎn)地的貫葉金絲桃進(jìn)行篩選及質(zhì)量控制，本試驗(yàn)選取不同產(chǎn)地的貫葉金絲桃藥材，并對(duì)該藥材的不同部位進(jìn)行單獨(dú)提取，以金絲桃苷含量為指標(biāo)，采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法檢測(cè)其含量[3，4]，為判斷金絲桃苷含量最高的貫葉金絲桃提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

125/166型HPLC儀（美國(guó)Beckman公司）；BC124S型萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；RE-201C型恒溫水浴鍋、08030125型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHE-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）；KQ-500E型醫(yī)用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器廠）。

金絲桃苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111521-200303）；甲醇（色譜純，韓國(guó)SK化工株式會(huì)社）；水為純化水。貫葉金絲桃購(gòu)自重慶慧遠(yuǎn)藥業(yè)有限公司，分別于2010年采自云南、四川、甘肅，均經(jīng)重慶市食品藥品檢驗(yàn)所鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Boston Breeze-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（40∶60，V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；流速：1.0 mL·min－1；進(jìn)樣量：20μL。在此色譜條件下，金絲桃苷與提取物中其他成分有較好的分離度。色譜見(jiàn)圖1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取金絲桃苷對(duì)照品3.5 mg，置于25 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并定容，得濃度為140μg·mL－1的對(duì)照品貯備液。精密吸取該溶液1 mL，置于100 mL量瓶中，用甲醇定容，即得濃度為1.4μg·mL－1的對(duì)照品溶液。

圖1 高效液相色譜圖A.對(duì)照品；B.陰性對(duì)照；C.供試品；1.金絲桃苷Fig 1 HPLCchromatogramsA.substancecontrol；B.negativecontrol；C.test sample；1.hyperoside

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取貫葉金絲桃的花、葉（貫葉金絲桃全草的中上段長(zhǎng)有花、葉，故在本試驗(yàn)中合為一個(gè)部位計(jì)算）和莖部位各5.0 g，剪碎，放入燒瓶中，加100 mL無(wú)水乙醇，超聲（功率：500 W，頻率：400 kHz）提取10 min，再80℃水浴回流2 h。真空抽濾，濾液于4℃貯藏，濾渣加50 mL無(wú)水乙醇，重復(fù)回流提取2次，合并濾液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于80℃下濃縮，將濃縮液溶解于10 mL二甲基亞砜中，并移至50 mL棕色量瓶，用甲醇定容，得樣品提取液。吸取相應(yīng)量樣品提取液（花、葉部位提取液取1 mL，莖部位提取液取10 mL），分別置10 mL棕色量瓶中，用甲醇定容，1 000 r·min－1離心10 min，取上清液，即得到不同產(chǎn)地不同部位貫葉金絲桃的供試品溶液。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備

取適量無(wú)水乙醇置燒瓶中，按“2.3”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.5 線性關(guān)系考察

精密量取140μg·mL－1的對(duì)照品貯備液10、25、50、100、200μL，置10 mL棕色量瓶中，用甲醇定容，得濃度分別為0.14、0.35、0.70、1.40、2.80μg·mL－1的對(duì)照品溶液。按上述色譜條件，每個(gè)濃度進(jìn)樣3次，每次進(jìn)樣20μL，測(cè)定峰面積。以對(duì)照品的進(jìn)樣濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝2.171 9X+0.066 6（r＝0.999 4，n＝5）。結(jié)果表明，金絲桃苷進(jìn)樣濃度在0.14～2.80μg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密量取對(duì)照品貯備液50μL，置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇定容，得濃度為0.70μg·mL－1的溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣20μL，測(cè)定峰面積。結(jié)果，RSD＝1.54%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一產(chǎn)地同一部位（甘肅藥材的花、葉部位）樣品適量，按“2.3“項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液。將供試品溶液分別稀釋100倍，按上述色譜條件分批進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，RSD＝6.1%（n＝6）。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批樣品（甘肅藥材的花、葉部位）的供試品溶液適量，稀釋100倍后于0、1、2、3、4 h時(shí)間點(diǎn)按上述色譜條件分別進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積。結(jié)果，RSD＝1.73%（n＝5），表明供試品溶液在4 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已測(cè)定金絲桃苷含量的同一批樣品（甘肅藥材的花、葉部位）適量，共6份，分別精密加入金絲桃苷對(duì)照品適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，稀釋100倍后按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.10 樣品含量測(cè)定

取3個(gè)產(chǎn)地不同部位的貫葉金絲桃藥材適量，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算樣品中金絲桃苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同產(chǎn)地不同部位貫葉金絲桃中金絲桃苷的含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Content determination of hyperoside in H.perforatum from different habitats（n＝3）

3 討論

由表2可知，不同產(chǎn)地不同部位的金絲桃苷含量具有差異，花、葉中的金絲桃苷含量普遍較莖中高；不同產(chǎn)地花、葉中的金絲桃苷含量比較，四川＞云南＞甘肅；不同產(chǎn)地莖中的金絲桃苷含量比較，甘肅＞云南＞四川。故在金絲桃苷提取試驗(yàn)中，建議選取四川產(chǎn)地貫葉金絲桃的花、葉部位為提取原料。

由線性關(guān)系考察結(jié)果可知，金絲桃苷進(jìn)樣濃度在0.14～2.80μg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。但由于不同產(chǎn)地不同部位的金絲桃苷含量差異較大，在取用藥材時(shí)可能導(dǎo)致取材的不均一性，因此在重復(fù)性試驗(yàn)中RSD＞6%。

綜上所述，本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高，可用于貫葉金絲桃的質(zhì)量控制，同時(shí)也為本課題組對(duì)金絲桃苷的進(jìn)一步研究提供了試驗(yàn)依據(jù)和技術(shù)支持。

[1] 胡 然，庫(kù)寶善，張永鶴.人類免疫缺陷病毒與皰疹病毒感染具有相關(guān)性[J].生理科學(xué)進(jìn)展，2004，35（1）：63.

[2] 李敏芳，李 慧，王學(xué)美.金絲桃苷藥理研究進(jìn)展[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2008，15（4）：102.

[3] 譚道鵬，桂 新，王崢濤.HPLC測(cè)定千柏鼻炎片中對(duì)羥基桂皮酸和金絲桃苷的含量[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2010，27（6）：532.

[4] 樊敏偉，馬能溢，王 冰，等.高效液相色譜法測(cè)定貫葉金絲桃提取物緩釋膠囊中金絲桃苷的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2007，13（11）：9.

Content Determination of Hyperoside in Different Parts of Hypericum perforatum from Different Habitats by RP-HPLC

LI Zhuo-heng，MENG De-sheng，LU Lai-chun，ZHOU Wei，YU Cai-ping，OU Shun-long，WU Wei
（Dept.of Pharmacy，Institute of Field Surgery，Daping Hospital of Third Military Medical University，Chongqing 400042，China）

OBJECTIVE：To develop the method for the content determination of hyperoside in Hypericum perforatum，and to determine the content of hyperoside in different parts of H.perforatum from different habitats.METHODS：RP-HPLC method was adopted.The determination was performed on Boston Breeze-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）column with mobile phase consisted of methanol-0.1%phosophoric acid（40∶60，V/V）at the flow rate of 1.0 mL·min－1.The detection wavelength was set at 360 nm.RESULTS：The linear rang of hypericin was 0.14～2.80μg·mL－1（r＝0.999 4）with an average recovery of 95.97%（RSD＝1.16%，n＝6）.The contents of hypericin in the flowers and leaves of H.perforatum from Sichuan province were the highest.CONCLUSION：The method is simple，accurate and reproducible for the quality control of H.perforatum.

Hypericum perforatum；Hyperoside；RP-HPLC；Content determination；Habitats

R284.1；R927.2

A

1001-0408（2012）43-4082-02

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2012.43.19

Δ國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81073157）；重慶市科技攻關(guān)課題（CSTC，2010AC5023）

＊藥師，碩士。研究方向：藥學(xué)及新藥研發(fā)。電話：023-68757098。E-mail：cissylzh@yahoo.cn

#通訊作者：主管藥師，碩士。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)及新藥研發(fā)。電話：023-68757099。E-mail：cqcx@163.com

2011-12-22

2012-05-03）