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    丹皮酚脂質(zhì)體的制備與質(zhì)量評價

    2012-11-30 02:33:20王海龍于珊珊趙美玲劉善奎
    中國藥房 2012年43期
    關(guān)鍵詞:卵磷脂丹皮脂質(zhì)體

    王海龍,于珊珊,趙美玲,劉善奎

    (濟(jì)南大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,濟(jì)南250022)

    丹皮酚脂質(zhì)體的制備與質(zhì)量評價

    王海龍*,于珊珊,趙美玲,劉善奎#

    (濟(jì)南大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,濟(jì)南250022)

    目的:制備丹皮酚脂質(zhì)體,并評價其質(zhì)量。方法:采用薄膜分散-水化法制備丹皮酚脂質(zhì)體。以丹皮酚與大豆卵磷脂重量比、膽固醇與大豆卵磷脂重量比、水化介質(zhì)磷酸鹽緩沖液(PBS)的pH值為考察因素,以包封率為評價指標(biāo),采用正交試驗優(yōu)選工藝,并考察丹皮酚脂質(zhì)體的質(zhì)量。結(jié)果:優(yōu)選的制備工藝為丹皮酚與大豆卵磷脂的重量比為1∶20,膽固醇與大豆卵磷脂的重量比為1∶4,水化介質(zhì)PBS的pH值為6.5。制得的丹皮酚脂質(zhì)體顆粒圓整,平均粒徑為95 nm,包封率達(dá)到91.3%,在4℃下穩(wěn)定性良好。結(jié)論:所選工藝穩(wěn)定、可行,制得的制劑質(zhì)量合格。

    丹皮酚;脂質(zhì)體;薄膜分散-水化法;質(zhì)量評價

    丹皮酚(Paeonol)系從毛茛科植物牡丹(Paeonia suffruticosa)的根皮、蘿藦科植物徐長卿(Cynanchum paniculatum)的全草等植物中提取的主要活性成分,除了具有抑菌抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、降壓等作用外,還具有較強(qiáng)的抗癌活性。它能通過影響腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)等機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡,對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用[1]。目前臨床應(yīng)用的丹皮酚劑型有注射劑、軟膏劑、微乳、凝膠等[2,3]。本試驗將丹皮酚制成丹皮酚脂質(zhì)體(Paeonol liposomes),可增強(qiáng)其對腫瘤細(xì)胞的靶向性,并降低毒副作用。

    1 儀器與試藥

    RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);RQ2200B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);XSB-101B光學(xué)顯微鏡(濟(jì)南強(qiáng)勝光電儀器有限公司);FA1104B電子分析天平(上海越平科技儀器有限公司);SH2-(D)Ⅲ循環(huán)水式真空泵(上海一展實驗設(shè)備有限公司);800電動離心機(jī)(常州博遠(yuǎn)實驗分析儀器廠);TU-1818紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司);H-800透射電子顯微鏡(日本日立公司);Winner801光子相關(guān)納米粒度儀(濟(jì)南微納顆粒儀器股份有限公司);9800 Zeta電位儀(貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司)

    丹皮酚對照品(上海銳谷生物科技有限公司,純度≥99%);丹皮酚(四川博興實業(yè)有限公司,批號:20100910);大豆卵磷脂(德國Lipoid公司,批號:790641-09,含量≥94.7%);膽固醇(廈門星隆達(dá)化學(xué)試劑有限公司,批號:20061212);Sephadex-G50葡聚糖(100~300μm,美國Pharmacia公司);甲醇(分析純,天津市廣成化學(xué)試劑有限公司);無水乙醇(分析純,天津市登科化學(xué)試劑有限公司);其他試劑均為分析純。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 丹皮酚脂質(zhì)體的制備

    2.1.1 正交試驗設(shè)計 根據(jù)文獻(xiàn)和預(yù)試驗結(jié)果,選取丹皮酚與大豆卵磷脂重量比(A)、膽固醇與大豆卵磷脂重量比(B)、水化介質(zhì)磷酸鹽緩沖液(PBS)的pH值(C)為考察因素,每個因素選取3個水平,按正交試驗L9(34)表進(jìn)行試驗。因素水平見表1。

    表1 因素水平Tab 1 Factors and levels

    2.1.2 丹皮酚脂質(zhì)體的制備 按表1設(shè)計方案稱取適當(dāng)重量的丹皮酚、膽固醇、大豆卵磷脂于小燒杯中,加入適量無水乙醇溶解,然后將混合溶液轉(zhuǎn)移入500 mL圓底燒瓶中,加入玻璃珠少許,于45℃水浴緩慢旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā),直至完全除去有機(jī)溶劑,形成均勻透明的薄膜。加入適量PBS進(jìn)行水化至溶液透明無不溶物,超聲(功率:100 W,頻率:40 kHz)處理20 min,得到丹皮酚脂質(zhì)體混懸液。將此混懸液分別通過0.80、0.54、0.22μm的微孔濾膜,即得丹皮酚脂質(zhì)體,置于4℃冰箱冷藏,備用。

    2.2 丹皮酚脂質(zhì)體包封率的測定

    2.2.1 測定波長的選擇 取丹皮酚的甲醇溶液、空白脂質(zhì)體和丹皮酚脂質(zhì)體各適量,分別用甲醇破乳完全,直至溶解制成澄清溶液。上述3種溶液分別在200~400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描。結(jié)果,丹皮酚在274 nm波長處有最大吸收,而空白脂質(zhì)體在220 nm波長左右有強(qiáng)吸收,在274 nm波長處基本無吸收,對丹皮酚的測定不造成干擾。因此,選擇測定波長為274 nm,并以空白脂質(zhì)體同法處理作為空白對照溶液。紫外吸收圖譜見圖1。

    圖1 紫外吸收圖譜1.丹皮酚脂質(zhì)體;2.丹皮酚;3.空白脂質(zhì)體Fig 1 UV absorption spectrum1.paeonol liposome;2.paeonol;3.blank liposome

    2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取丹皮酚對照品適量,加甲醇適量制成15μg·mL-1的貯備液。取6支10 mL量瓶,分別精密加入0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL上述貯備液,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,于274 nm波長處測定吸光度。以吸光度(A)為縱坐標(biāo),丹皮酚檢測濃度(c,mg·mL-1)為橫坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,得回歸方程為A=93.76c-0.002 3(r=0.999 9,n=6)。結(jié)果表明,丹皮酚檢測濃度在0.75~12.00μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

    2.2.3 測定方法 制備充填Sephadex-G50葡聚糖的凝膠柱(直徑:8 mm,高:12 mm),用PBS以0.2 mL·min-1的流速沖洗平衡2 h,備用。取稀釋后的丹皮酚脂質(zhì)體0.2 mL,加至Sephadex-G50凝膠柱上,以PBS為洗脫液,流速為0.2 mL·min-1,進(jìn)行洗脫,共收集第1~5 mL乳白色丹皮酚脂質(zhì)體流出組分5 mL,另收集第7~12 mL游離丹皮酚流出組分6 mL。分別精密量取上述丹皮酚脂質(zhì)體和游離丹皮酚流出組分各1 mL,置于10 mL量瓶中,加甲醇充分破乳,再加PBS至刻度,搖勻,于274 nm波長處測定吸光度,按下式計算包封率:包封率=A脂/(A脂+A游)×100%(式中,A脂為丹皮酚脂質(zhì)體流出組分的吸光度;A游為游離丹皮酚流出組分的吸光度)。

    2.2.4 洗脫曲線測定 取丹皮酚脂質(zhì)體0.2 mL,充填于Sephadex-G50凝膠柱上,按“2.2.3”項下方法進(jìn)行洗脫,自上樣開始,分別收集每1 mL洗脫液,加甲醇破乳,于274 nm波長處測定吸光度,根據(jù)回歸方程計算丹皮酚的濃度。以洗脫體積對丹皮酚濃度作洗脫曲線。結(jié)果,丹皮酚脂質(zhì)體的出峰體積在第1~4 mL之間,游離丹皮酚的出峰體積在第7~12 mL之間。另取0.2 mL藍(lán)色葡聚糖2000水溶液加于Sephadex-G50凝膠柱上,以PBS洗脫,根據(jù)顏色標(biāo)志,洗脫出葡聚糖2000前接收到PBS 5 mL。采用藍(lán)色葡聚糖2000試驗的結(jié)果與采用丹皮酚脂質(zhì)體的試驗結(jié)果一致,表明回收率測定時以收集第1~4 mL的丹皮酚脂質(zhì)體溶液進(jìn)行破乳為宜。Sephadex-G50凝膠柱洗脫曲線見圖2。

    圖2 Sephadex-G50凝膠柱洗脫曲線1.原始曲線;2.擬合曲線Fig 2 Sephadex-G50 gel column elution curve1.original curves;2.fitted curves

    2.2.5 精密度試驗 取同一份丹皮酚脂質(zhì)體,照“2.2.3”項下方法測定包封率,共測5次。結(jié)果,包封率分別為90.3%、91.5%、90.8%、89.9%、89.6%,平均包封率為90.4%,RSD=0.8%(n=5)。另取一份丹皮酚脂質(zhì)體,在同一日的早、中、晚不同時間測定包封率,考察日內(nèi)精密度;連續(xù)5 d,每天在同一時間測定包封率,考察日間精密度。結(jié)果,日內(nèi)平均包封率為90.6%,RSD=1.3%(n=3);日間平均包封率為92.1%,RSD=1.7%(n=5),表明本方法精密度良好。

    2.2.6 回收率試驗 取3份丹皮酚脂質(zhì)體,按“2.2.3”項下方法分別測得丹皮酚脂質(zhì)體和游離丹皮酚流出組分的吸光度,根據(jù)回歸方程計算包含的丹皮酚脂質(zhì)體和游離丹皮酚的含量;另取等量丹皮酚脂質(zhì)體,不過Sephadex-G50葡聚糖柱,加PBS稀釋后直接加甲醇破乳,于274 nm波長處測定吸光度,同法計算體系中總的丹皮酚含量。按下式計算回收率:回收率=(m脂+m游)/m總×100%(式中,m脂為丹皮酚脂質(zhì)體中丹皮酚量;m游為游離的丹皮酚含量;m總為體系中總的丹皮酚含量)。結(jié)果,3批丹皮酚脂質(zhì)體中丹皮酚的平均回收率為98.1%,RSD=1.9%(n=3)。

    2.3 正交試驗結(jié)果

    將“2.1.2”項下制備的丹皮酚脂質(zhì)體分別按“2.2.3”項下方法測定包封率,并以此為評價指標(biāo)優(yōu)選工藝。正交試驗結(jié)果見表2;方差分析結(jié)果見表3。

    表2 正交試驗結(jié)果Tab 2 Resultsof orthogonal test

    由表2、表3可知,各因素對包封率的影響大小順序為A>C>B,且都具有顯著性影響(P<0.05或P<0.01),最佳處方工藝組合為A1B3C3,即丹皮酚與大豆卵磷脂的重量比為1∶20,膽固醇與大豆卵磷脂的重量比為1∶4,水化介質(zhì)PBS的pH值為6.5。此條件下,可制備得到包封率較高的丹皮酚脂質(zhì)體。

    表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Analysis of variance

    2.4 丹皮酚脂質(zhì)體的質(zhì)量評價

    2.4.1 微觀形態(tài)和粒徑 采用負(fù)染法對樣品進(jìn)行前處理。將樣品用去離子水稀釋后置于附有薄膜的銅網(wǎng)上,樣品用醋酸雙氧鈾飽和溶液負(fù)染30 s后,抽真空條件下,透射電鏡觀察其形態(tài)。同時,采用微粒粒度測定儀對其進(jìn)行粒度測定:將樣品用已通過0.22μm微孔濾膜的注射用水稀釋約5 000倍,立即放入樣品池內(nèi),光源為HeNe激光(λ0=633 nm),溫度為室溫(25℃),測定其光強(qiáng)度徑,至Time history曲線趨于直線時停止測定,保存數(shù)據(jù)。結(jié)果,電鏡下可見新制備的丹皮酚脂質(zhì)體外觀呈近球形,說明形成了包裹有丹皮酚的脂質(zhì)體;粒徑分布圖顯示得到的脂質(zhì)體粒徑分布均勻,為48~175 nm,平均粒徑為95 nm。丹皮酚脂質(zhì)體電鏡照片見圖3;丹皮酚脂質(zhì)體粒徑及其分布見圖4。

    圖3 丹皮酚脂質(zhì)體電鏡照片(36 000×)Fig 3 SEM photos of paeonol liposomes(36 000×)

    圖4 丹皮酚脂質(zhì)體粒徑及其分布Fig 4 Particle size distribution of paeonol liposomes

    2.4.2 包封率的測定 按“2.3”項下最優(yōu)工藝制備5批丹皮酚脂質(zhì)體,照“2.2.3”項下方法測定包封率。結(jié)果,平均包封率為91.3%,RSD=1.2%(n=5)。

    2.4.3 初步穩(wěn)定性試驗 將制備的丹皮酚脂質(zhì)體(批號:20110105)在冰箱冷藏室(4℃)放置2個月后,外觀沒有發(fā)生明顯改變;0、10、20、30、60 d的平均包封率分別為 91.6%、89.4%、90.2%、88.3%、88.7%;脂質(zhì)體的pH值和過氧化值均沒有變化,大豆卵磷脂沒有發(fā)生明顯自身氧化,未產(chǎn)生過氧化物、丙二醛、脂肪酸和溶血磷脂等有害物質(zhì)。這表明4℃冷藏條件下,制備的丹皮酚脂質(zhì)體較穩(wěn)定。

    3 討論

    脂質(zhì)體的制備方法有很多,常用的有薄膜分散法、逆相蒸發(fā)法、溶劑注入法、超聲分散法、冷凍干燥法等[4,5]。脂質(zhì)體的制備工藝對其粒徑、包封率等理化特性影響較大,如脂質(zhì)體粒徑<50 nm時會較多地分布于骨髓,而粒徑在100~300 nm時會更多地分布于淋巴,7~30μm粒子則由于機(jī)械作用分布于肺部,更大的粒子則被用來局部栓塞,所以穩(wěn)定并經(jīng)過優(yōu)化的工藝對保證脂質(zhì)體質(zhì)量極為重要。在采用薄膜分散-水化法制備脂質(zhì)體的工藝時,筆者發(fā)現(xiàn)影響因素很多,除文中已涉及的以外,還有蒸發(fā)燒瓶的大小、傾斜角度、蒸發(fā)過程中的真空度等也對脂質(zhì)體理化特性有一定影響,但影響較輕微,所以本試驗在正交試驗中未考慮這些因素。筆者經(jīng)過較少的試驗得到比較理想的結(jié)果,所制脂質(zhì)體十分穩(wěn)定,為后續(xù)療效評價打下了較好的基礎(chǔ)。

    丹皮酚在274 nm波長處有強(qiáng)烈的紫外吸收[6],因而利用這一性質(zhì)進(jìn)行脂質(zhì)體包封率的測定。在包封率測定方法的研究中,脂質(zhì)體和不溶性藥物的結(jié)晶如何完全分離一直是比較難以解決的問題。在本試驗中,丹皮酚在水中的表觀溶解度為0.386 mg·mL-1,溶解度較大[7],不容易形成結(jié)晶,因而可以采用凝膠層析法將脂質(zhì)體和游離藥物完全分離。測定包封率時采用甲醇進(jìn)行破乳應(yīng)使體系中甲醇的量足夠,才能破乳完全,否則丹皮酚的吸收曲線會發(fā)生較大變化導(dǎo)致無法測定。

    [1] 孫言才,沈玉先,孫國平.丹皮酚的主要藥理活性研究進(jìn)展[J].中成藥,2004,26(7):579.

    [2] 鄧步華,楊宗發(fā).丹皮酚-β-環(huán)糊精包合物處方工藝研究[J].中國藥房,2009,20(25):1 965.

    [3] 邢國勝,房德敏,周詠梅,等.丹皮酚的制備及藥理作用研究進(jìn)展[J].中草藥,2006,37(11):附2.

    [4] Nii T,Ishii F.Encapsulation efficiency of water-soluble and insoluble drugs in liposomes prepared by the microencapsulation vesicle method[J].Int JPharm,2005,298(1):198.

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    [7] 王 森,朱衛(wèi)豐,歐水平,等.丹皮酚理化性質(zhì)及體外經(jīng)皮滲透性的研究[J].中藥新藥與臨床藥理,2011,21(2):215.

    Preparation and Quality Evaluation of Paeonol Lipsomes

    WANG Hai-long,YU Shan-shan,ZHAO Mei-ling,LIU Shan-kui
    (College of Medical and Life Science,University of Jinan,Jinan 250022,China)

    OBJECTIVE:To prepare Paeonol liposomes,and to evaluate its quality.METHODS:Paeonol lipsomes were prepared by film dispersion-evaporation method.The preparation technology was optimized by orthogonal experiment with ratio of paeonol to soybean lecithin,ratio of cholesterol to soybean lecithin and pH value of PBS as factors using entrapment efficiency as index.The quality of Paeonol lipsomes was evaluated.RESULTS:Optimized technology was as follows:ratio of paeonol to soybeanl ecithin 1∶20,ratio of cholesterol to soybean lecithin 1∶4,pH value of PBS 6.5.Paeonol liposomes were round and regular in appearance with means particle size of 95 nm,and the entrapment efficiency of then was up to 91.3%.The preparation was stable at 4℃.CONCLUSION:The technology is stable and practicable,and the quality of preparation is well.

    Paeonol;Liposomes;Film dispersion-evaporation method;Quality evaluation

    R283.69;R918

    A

    1001-0408(2012)43-4065-03

    DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2012.43.13

    *講師,碩士。研究方向。藥物制劑分析。電話:0531-89736825。E-mail:chm_wanghl@ujn.edu.cn

    #通訊作者:副教授,博士。研究方向:藥物制劑。電話:0531-89736825。E-mail:chm_liusk@ujn.edu.cn

    2011-11-19

    2012-02-08)

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