和解聚散方對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織蛋白激酶C表達(dá)的影響*

崔 瑾 王耀獻(xiàn) 孫衛(wèi)衛(wèi) 劉尚建 沈 存 呂 杰 王曉楠

（北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬東直門醫(yī)院，北京 100700）

腎間質(zhì)纖維化是多種慢性腎臟病進(jìn)行性發(fā)展的最終結(jié)果，它以過量細(xì)胞外基質(zhì)在腎間質(zhì)積聚及腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生為特征。研究表明蛋白激酶（PKC）同工酶位于腎間質(zhì)纖維化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的上游，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的產(chǎn)物在腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展過程中起十分重要的作用，因此調(diào)節(jié)PKC同工酶活性就可以在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)啟動階段防治腎間質(zhì)纖維化［1-2］。和解聚散方是王耀獻(xiàn)教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗總結(jié)得出，能夠改善腎功能，延緩終末期腎臟病進(jìn)程［3-5］?；谝陨侠碚摷扒捌谘芯拷Y(jié)果，本文擬重點探討和解聚散方抗腎纖維化的作用機(jī)制是否與抑制大鼠腎組織PKC的表達(dá)有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 清潔級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量180～220g，購自維通利華實驗動物公司。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、洛丁新組、和解聚散方組，各10只，供給清潔大鼠飼料，自由飲水、進(jìn)食，每籠5只，保持籠內(nèi)清潔。

1.2 藥物與試劑 和解聚散方由黃芪、當(dāng)歸、海藻、牡蠣、穿山甲等藥物組成，來源于東直門醫(yī)院中藥房，由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院制成煎劑，濃縮后高溫消毒封裝備用，質(zhì)量濃度為每毫升含生藥1g。鹽酸苯那普利（洛丁新）購自北京諾華制藥有限公司。兔抗鼠PKC（武漢博士德生物工程有限公司），DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），兩步法免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）

1.3 造模及給藥 采用右側(cè)輸尿管結(jié)扎手術(shù)制備單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）模型，模型組、洛丁新組、和解聚散方組以5%水合氯醛腹腔注射將大鼠麻醉后局部剃毛，常規(guī)消毒鋪孔巾，選擇背部正中線肋脊角旁開1cm切口，依次切開皮膚至腹腔，游離腎臟及輸尿管，將右側(cè)輸尿管結(jié)扎，然后連續(xù)縫合皮膚。假手術(shù)組手術(shù)入路方式同模型組，進(jìn)入腹腔后分離右輸尿管但不結(jié)扎輸尿管。造模術(shù)后24h開始分別灌胃，假手術(shù)組、模型組灌胃生理鹽水（3mL/只），洛丁新組灌胃洛丁新［1.0mg/（kg·d）］，和解聚散方組灌胃和解聚散方［9.8g/（kg·d）］。于造模術(shù)后第7日處死大鼠，留取梗阻側(cè)腎組織備用。

1.4 標(biāo)本采集與檢測 （1）腎組織病理檢查：取梗阻側(cè)腎組織，以4%多聚甲醛固定后，脫水、浸蠟、石蠟包埋，切成3μm厚度的切片，分別行HE染色及Masson染色，光鏡下觀察腎臟皮質(zhì)區(qū)及皮髓交界區(qū)腎小管、腎間質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化。（2）免疫組化檢測：使用兩步法免疫組化試劑盒，操作步驟按試劑盒說明進(jìn)行，PBS代替一抗作為陰性對照，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，采用光學(xué)顯微鏡（400×）觀察皮質(zhì)腎小管間質(zhì)區(qū)PKC-βⅡ的表達(dá)，以光鏡下細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性信號。半定量分析采用Image Proplus 6.0多媒體彩色病理圖像分析軟件。光鏡下在皮質(zhì)區(qū)選取10個不重疊視野，盡量避開腎小球和血管，計算陽性表達(dá)面積占總面積的百分比。

2 結(jié) 果

2.1 病理學(xué)改變 HE、Masson染色觀察：假手術(shù)組腎間質(zhì)無纖維化；模型組出現(xiàn)腎間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤，間質(zhì)水腫，且伴有不同程度的腎小管上皮細(xì)胞腫脹、空泡變性及腎小管灶狀萎縮，小管管腔閉塞和（或）擴(kuò)張，部分腎小管腔內(nèi)有蛋白或細(xì)胞管型，間質(zhì)纖維化；洛丁新組、和解聚散方組病理變化較模型組減輕。

2.2 免疫組織化學(xué)和半定量分析 見表1。假手術(shù)組中PKC-βⅡ只在腎小管間質(zhì)細(xì)胞胞漿有少量表達(dá)；模型組、洛丁新組、和解聚散方組可見大量陽性表達(dá)出現(xiàn)在腎小管間質(zhì)細(xì)胞膜，同時部分小管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)也出現(xiàn)陽性染色顆粒。半定量分析顯示模型組中PKC-βⅡ在術(shù)后7d明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05），兩個治療組的表達(dá)水平明顯低于模型組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠腎小管間質(zhì)PKC-βⅡ表達(dá)比較（）

表1 各組大鼠腎小管間質(zhì)PKC-βⅡ表達(dá)比較（）

與模型組比較，*P＜0.05；與洛丁新組比較，△P＜0.05。

組別 n PKC-βⅡ陽性表達(dá)面積（%）假手術(shù)組 10 2.1130±0.66269*模型組 10 8.8348±2.97066△洛丁新組 10 4.3774±1.23522*和解聚散方組 10 4.2757±0.60625*

3 討 論

UUO模型是目前公認(rèn)的較為成熟的一種研究腎小管間質(zhì)纖維化的實驗動物模型。輸尿管結(jié)扎導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化，在本實驗中亦得到證實。

PKC屬于絲氨酸、蘇氨酸（Ser/Thr）激酶家族中的一員，它不是單一分子的酶，而是一組密切相關(guān)的有多種亞型的蛋白質(zhì)超家族。迄今為止，PKC至少有12種異構(gòu)體，經(jīng)典PKC包括PKC-α、βⅠ、βⅡ和γ。有研究顯示，PKCβⅡ表達(dá)于上皮細(xì)胞，可調(diào)節(jié)NF-κB的活性，從而參與炎癥纖維化。靜息狀態(tài)下PKC主要以無活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，受到外界刺激時受其特異性底物蛋白吸引自胞質(zhì)向胞膜轉(zhuǎn)移，通過多種膜蛋白的磷酸化作用使構(gòu)象改變，假底物與催化區(qū)解離，導(dǎo)致PKC激活［6］。始動因子PKC的膜轉(zhuǎn)移現(xiàn)象為PKC激活的重要標(biāo)志。腎組織PKC表達(dá)增高，將介導(dǎo)細(xì)胞增殖和分化，調(diào)節(jié)多種基因表達(dá)，如TGF-β，NF-κB等，促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化形成。因此，抑制PKC的表達(dá)有利于防治腎纖維化。

腎纖維化的中醫(yī)病機(jī)是“腎絡(luò)微型癥瘕”形成，消癥散結(jié)在腎纖維化的治療中具有重要意義。王耀獻(xiàn)教授創(chuàng)立和解聚散方，并以此加減治療慢性腎臟病，在臨床中取得了較好療效。和解聚散方由黃芪、當(dāng)歸、海藻、牡蠣、穿山甲等藥物組成，方中以黃芪、當(dāng)歸為君，補(bǔ)血活血，補(bǔ)氣扶正；穿山甲、海藻、牡蠣為臣，消癥散結(jié)，諸藥共奏和解聚散，扶正通絡(luò)之功。全方虛實并調(diào)，標(biāo)本兼顧，為治療腎纖維化的有效方劑。藥理研究亦證實，黃芪能清除氧自由基，通過抑制TGF-β產(chǎn)生，減少ECM生成，調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫及體液免疫，降低尿蛋白，保護(hù)腎功能［7］。

本實驗結(jié)果表明：和解聚散方能夠降低UUO大鼠腎組織中PKC的產(chǎn)生，減緩腎纖維化的發(fā)展。充分說明了和解聚散方具有良好的抗腎纖維化作用，抑制腎組織PKC的表達(dá)是其抗腎纖維化的機(jī)制之一，也說明了本方是一種防治延緩慢性腎臟病進(jìn)展的有效中成藥物，有必要進(jìn)行深入研究和臨床推廣應(yīng)用。

［1］Sanchez LE，Rodriguez VJ，Cartier C，et al.Inhibitory effect of interleukin-1 beta on angiotensinⅡ-induced connective tissue growth factor and typeⅣ collagen production in cultured mesangial cells［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2008，294（1）：F149-F160.

［2］Fields AP，Regala RP.Protein kinase Ciota：humanoncogene，Prognostic marker and therapeutic target［J］.Pharmacol Res，2007，55（6）：487-497.

［3］王耀獻(xiàn)，劉尚健，孫魯英，等.腎炎防衰治療慢性腎小球腎炎60例臨床觀察［J］.中國中藥雜志，2005，30（7）：555-556.

［4］王耀獻(xiàn)，劉尚健，趙宗江，等.腎炎防衰液對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠的治療作用［J］.中國中藥雜志，2005，30（10）：796-797.

［5］王耀獻(xiàn)，劉尚健，趙宗江，等.腎炎防衰液對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎臟保護(hù)作用［J］.中醫(yī)藥學(xué)刊，2005，23（3）：458-461.

［6］Dris I，Gray S，Donnelly R.Protein kinase C activation：isozyme specific effects on metabolism and cardiovascular complications in diabetes［J］.Diabetologia，2001，44（6）：659-673.

［7］張翥，方敬愛，葉任高.中藥的腎保護(hù)與腎毒性［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2001，2（9）：552-553.