高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定青蒿綠原酸、隱綠原酸、東莨菪內(nèi)酯含量*

孫玉剛 ，秦續(xù)文 ，張 玲 ，李 晉 ，蕭 偉 ，王振中 ，成志東 ，常艷旭 ，，3

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193；2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司博士后工作站，連云港 222001；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，中藥化學(xué)與分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193）

青蒿為菊科植物黃花蒿（Artemisia annua L.）的干燥全草,具有清熱解毒[1]、抗瘧等功效[2]。青蒿藥用歷史悠久,在全國(guó)各地均有分布。研究表明青蒿素及其衍生物是青蒿抗瘧的主要有效成分，并被研制成抗瘧新藥,是世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的治療瘧疾的首選藥物。同時(shí)，青蒿作為常用中草藥，是臨床有效中藥熱毒寧注射液的重要組成部分，在熱毒寧注射液臨床療效起著重要的作用。

青蒿的化學(xué)成分種類(lèi)較多,主要有黃酮類(lèi)、香豆素、萜類(lèi)、苯丙酸類(lèi)和揮發(fā)油[3]。綠原酸、隱綠原酸作為熱毒寧注射液有效成分[4]，在青蒿有分布[5]。香豆素成分可能是青蒿解熱降溫療效的有效部位[6]，主要有東莨菪內(nèi)酯、香豆素等。目前,青蒿中青蒿素、黃酮類(lèi)和香豆素類(lèi)成分均有含量測(cè)定的報(bào)道[7-9]，但是綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內(nèi)酯同時(shí)測(cè)定方法未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首次建立了高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測(cè)定青蒿中綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內(nèi)酯含量的方法，并對(duì)人工種植青蒿中以上3種成分含量進(jìn)行測(cè)定，擬為青蒿藥材的規(guī)范化種植及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供研究手段。

1 儀器與試劑

Waters 2695高效液相色譜儀,Waters 2487雙波長(zhǎng)檢測(cè)器，Agilent Zorbax SB-C18反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。甲醇和乙腈為色譜純（天津康科德科技有限公司），水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內(nèi)酯等標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自成都曼斯特生物技術(shù)有限公司，經(jīng)色譜法檢測(cè)純度在98%以上。6批青蒿樣品采自江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司東?？h青蒿基地（2010年10月），自然曬干，含量測(cè)定前60℃下烘干12 h，粉碎后過(guò)100目篩，得粉末。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相:A 乙腈，B 0.1%甲酸水；梯度洗脫程序：0～6 min，9%～10%A；6～12 min，10%～11%A；12～25 min，11%～12%A；25～30 min，12%～13%A；30～35 min，13%～13%A；9%A 平衡5 min流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：325 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：35 ℃。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品適量，精密稱定，加60%甲醇溶解并稀釋，制成濃度分別為30.9、31.2、30.3 μg/mL混合對(duì)照品液。

2.3 供試品溶液的制備 取青蒿粉末0.30 g，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加入60%甲醇定容至刻度，稱質(zhì)量，超聲60 min，放冷，稱定質(zhì)量，用60%甲醇補(bǔ)足失質(zhì)量，搖勻，14000 r/min離心10 min，取上清液，作為供試品溶液。

3 結(jié)果

3.1 色譜條件的優(yōu)化 色譜條件考察時(shí)，選擇乙腈-水作為流動(dòng)相,結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品的色譜峰分離度較差并且有一定拖尾現(xiàn)象。經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)后，最終確定以乙腈-0.1%甲酸溶液作為含量測(cè)定的流動(dòng)相,采用梯度洗脫，所得色譜峰峰形尖銳,分離度高，見(jiàn)圖1。

3.2 樣品提取條件的優(yōu)化 本研究采用了單因素分析方法，考察了超聲波法制備供試品溶液條件,比較了不同提取時(shí)間（20、30、40、50、60、80 min）、不同提取溶液甲醇濃度（40%、60%、80%、100%）對(duì)綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內(nèi)酯提取的影響,研究結(jié)果表明，3種有效成分隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)提取率變高，但在60 min時(shí)3種有效成分含量較高；而隨著甲醇濃度的升高，有效成分的提取率呈先上升后下降的趨勢(shì)，60%甲醇提取效果最好，因此，最后確定以60%甲醇超聲提取60 min為最佳提取條件。

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1 線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線、定量限、檢測(cè)限 精密稱取綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品適量,配制一系列不同濃度的對(duì)照品溶液,分別進(jìn)樣10 μL，按上述色譜條件測(cè)定其峰面積各個(gè)化合物的峰面積。以化合物進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為Y贊=19 327X+u="1（r=0.9999）、Y贊=10 063X-339.2（r＝0..2（＝）、Y贊=17 606X-7606（r＝0.9999），線性范圍分別為 0.515～30.900、0.520～31.200、0.501～30.300 μg/mL，檢測(cè)限分別為 0.103、0.104、0.202 μg/mL，定量限分別為 0.31、0.32、0.60 μg/mL。

3.3.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定其濃度，計(jì)算它們的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內(nèi)酯RSD分別為0.8%、1.7%和1.5%，表明該系統(tǒng)進(jìn)樣精密度良好。

3.3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品,制備供試品溶液6份，測(cè)定其濃度,計(jì)算它們的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內(nèi)酯RSD分別為2.8%、2.9%和2.8%，表明方法重復(fù)性好。

3.3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12、24 h 進(jìn)樣，測(cè)定其濃度，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內(nèi)酯RSD分別為2.7%、2.8%和2.8%，表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

3.3.5 加樣回收率 取已知含量的青蒿樣品粉末6份，每份約0.15 g，精密稱定，分別加入適量綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品，供試品溶液制備方法制備，并依法測(cè)定。計(jì)算回收率，結(jié)果表明綠原酸的平均回收率為100%，RSD為1.9%，隱綠原酸的平均回收率為102%，RSD為2.5%，東莨菪內(nèi)酯的平均回收率為99.7%，RSD為2.7%，說(shuō)明綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內(nèi)酯的提取和檢測(cè)方法可行。

以上青蒿有效成分定量方法學(xué)考察結(jié)果表明，該方法精密度、重復(fù)性、回收率結(jié)果均較好，能夠準(zhǔn)確、快速地測(cè)定青蒿藥材中綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內(nèi)酯3種成分的含量。

3.4 樣品測(cè)定 分別吸取對(duì)照品溶液和6批人工種植青蒿的供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀,按上述色譜條件測(cè)定,并計(jì)算綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內(nèi)酯的含量。結(jié)果見(jiàn)表1，可知人工種植青蒿綠原酸含量在（0.532±0.185）mg/g，隱綠原酸含量在（0.119±0.016）mg/g，東莨菪內(nèi)酯在（0.78±0.09）mg/g，人工種植青蒿有效成分相對(duì)比較穩(wěn)定。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定青蒿中綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內(nèi)酯含量的方法，并對(duì)其進(jìn)行了方法學(xué)考察。結(jié)果顯示該方法準(zhǔn)確度高，專屬性強(qiáng)、靈敏度及穩(wěn)定性均較好，測(cè)定結(jié)果能客觀準(zhǔn)確地反映青蒿藥材中綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內(nèi)酯的含量。

表1 人工種植青蒿綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內(nèi)酯含量測(cè)定結(jié)果Tab.1 Result of chlorogenic acid,cryptochlorogenic acid and scopoletin content of cultivated A.Annua L mg/g

測(cè)定結(jié)果表明，人工種植青蒿中東莨菪內(nèi)酯含量最高，綠原酸次之，隱綠原酸最低。青蒿中綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內(nèi)酯是熱毒寧注射液中重要的藥效成分，對(duì)其含量測(cè)定方法的研究，有利于從原材料對(duì)熱毒寧注射液進(jìn)行質(zhì)量控制。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)人工種植青蒿中的綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內(nèi)酯3種有效成分進(jìn)行了測(cè)定,今后還將對(duì)種植密度和環(huán)境條件對(duì)青蒿中3種有效成分含量的影響和不同生育期變化規(guī)律做進(jìn)一步研究,為青蒿規(guī)范化種植提供科學(xué)依據(jù)。

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