手足口合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立

林 宏，張 囡，陳雙璐，錢(qián)宇坤

（天津市兒童醫(yī)院，天津 300074）

手足口合劑為本院應(yīng)用4年的協(xié)定處方制劑，由黃芩、黃連、黃柏、蟬蛻、梔子、淡竹葉、蒲公英、僵蠶等多味中藥組成，具有瀉火解毒、解肌透疹的功效[1]，臨床用于手足口病的治療，可有效緩解癥狀，控制病情發(fā)展，已治愈了近千例患兒，取得了良好的療效，受到廣大患兒家長(zhǎng)的歡迎。

方中黃芩為君藥，其主要作用為清熱解毒涼血，常與黃連、梔子等配伍退熱療效顯著?，F(xiàn)代藥理研究其有解熱、鎮(zhèn)靜、抗微生物等作用。相關(guān)的研究報(bào)道[2-5]：黃芩苷含量測(cè)定方法有紫外分光光度法、薄層掃描法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）法、毛細(xì)管電泳法、離子色譜法（PIC）等。為了有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，筆者采用TLC法對(duì)方中黃芩、梔子、黃柏、蒲公英、黃連進(jìn)行了鑒別，采用高效液相色譜法對(duì)黃芩苷進(jìn)行了含量測(cè)定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-2010A高效液相色譜儀（日本島津）；LCsolution色譜工作站；雙頻恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；三用紫外分析儀（天津思利達(dá)色譜技術(shù)開(kāi)發(fā)中心）。

1.2 試藥 黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)110715-200815，供含量測(cè)定用）、鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)110821-200609）、梔子苷對(duì)照品（批號(hào) 110749-200714）、咖啡酸對(duì)照品（批號(hào)110885-200102）、黃連對(duì)照藥材、黃柏對(duì)照藥材、蒲公英對(duì)照藥材均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；色譜分析用甲醇、冰醋酸為色譜純，水為哇哈哈純凈水，其他試劑為化學(xué)純；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠）；手足口合劑（本院自制）。

2 薄層鑒別

2.1 黃芩 取黃芩苷對(duì)照品，加入甲醇適量，制成濃度為1 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。再取手足口合劑50 mL，置于水浴，蒸至約余10 mL，取出后，用稀鹽酸調(diào)節(jié)至pH值約為1，再用乙酸乙酯萃取2次，每次用量為20 mL，合并2次的乙酸乙酯液萃取液，經(jīng)減壓蒸干，將殘?jiān)屑? mL甲醇，并使溶解，此溶液作為供試品溶液。根據(jù)處方比例，稱(chēng)取除黃芩外的其余藥材，按合劑的制備工藝制成陰性樣品，再按照供試品溶液的制備方法，制得無(wú)黃芩的陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB）實(shí)驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，采用正丁醇-冰醋酸-水（7∶1∶2）為展開(kāi)劑，展開(kāi)距薄層板前沿8 mm處，取出，晾至全干，噴以5%三氯化鐵乙醇溶液顯色。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照溶液無(wú)相應(yīng)斑點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 黃芩的薄層色譜圖Fig.1 TLC atlas of Baicalin

2.2 黃連與黃柏 取鹽酸小檗堿對(duì)照品，加甲醇適量，制成濃度為0.2 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液；再分別稱(chēng)取黃柏對(duì)照藥材及黃連對(duì)照藥材各0.03 g，各加入甲醇3 mL，置超聲波清洗器中，超聲處理30 min后，濾過(guò)，取濾液作為對(duì)照藥材溶液。另取手足口合劑15 mL，置于蒸發(fā)皿中，加入硅藻土3 g，研勻，置于水浴上蒸至近干，殘留物中加入15 mL甲醇，置超聲波清洗器中，超聲處理30 min后，濾過(guò)，采用減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL，輕搖10秒，共搖2次即可，取上清液，作為供試品溶液。根據(jù)處方比例，稱(chēng)取除黃連和黃柏的其余藥材，按合劑的制備工藝制成陰性樣品，再按照供試品溶液的制備方法，制得無(wú)黃連與黃柏的陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB）實(shí)驗(yàn)，吸取上述5種溶液各4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，采用乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10∶6∶1∶1）做為展開(kāi)劑，將薄層板展開(kāi)至距前沿8 mm處，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材及對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的黃色熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照溶液無(wú)相應(yīng)斑點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 黃連與黃柏的薄層色譜圖Fig.2 TLC atlas of Coptis and Cortex Phellodendri

2.3 梔子 稱(chēng)取梔子苷對(duì)照品適量，加甲醇制成濃度為1 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。另取手足口合劑30 mL，用水飽和正丁醇振搖萃取3次，第1、2次用量為 20 mL，第 3次用量為 10 mL，合并3次的正丁醇提取液（A液），再用25 mL氨試液洗滌上述A液，棄去氨試液，繼續(xù)用經(jīng)正丁醇飽和的水溶液洗滌A液，共2次，每次用量為25 mL，棄去水溶液，取正丁醇液，加入適量的無(wú)水硫酸鈉，過(guò)濾，濾液減壓蒸干，加甲醇2 mL溶解，作為供試品溶液。根據(jù)處方比例，稱(chēng)取除梔子以外的其余藥材，按合劑的制備工藝制成陰性樣品，再按照供試品溶液的制備方法，制得無(wú)梔子的陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB）實(shí)驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，采用三氯甲烷-甲醇（11∶2）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照溶液無(wú)相應(yīng)斑點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 梔子的薄層色譜圖Fig.3 TLC atlas of Fructus Gardeniae

2.4 蒲公英 稱(chēng)取咖啡酸對(duì)照品適量，加入甲醇，制成濃度為0.5 mg/mL的對(duì)照品溶液。另取蒲公英對(duì)照藥材1 g，加乙酸乙酯10 mL，置超聲波清洗器中超聲提取20 min，過(guò)濾，濾液經(jīng)減壓蒸干，取殘?jiān)尤爰状? mL，使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。取手足口合劑30 mL，用乙酸乙酯振搖萃取2次，每次用量為20 mL，合并2次的乙酸乙酯提取液，經(jīng)減壓蒸干，取殘?jiān)尤爰状? mL溶解，作為供試品溶液。根據(jù)處方比例稱(chēng)取除蒲公英以外的其余藥材，按合劑的制備工藝制成陰性樣品，再按照供試品溶液的制備方法，制得無(wú)蒲公英的陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB）實(shí)驗(yàn)，分別吸取對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液、樣品溶液、陰性對(duì)照品溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，采用乙酸丁酯-甲酸-水（7∶2.5∶2.5）的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品及對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照溶液無(wú)相應(yīng)斑點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)圖4。

3 含量測(cè)定

3.1 色譜條件 色譜柱：Shim-packVP-ODS(150mm×

圖4 蒲公英的薄層色譜圖Fig.4 TLC atlas of Dandelion

4.6 mm）；流動(dòng)相：甲醇-水-冰醋酸（40∶60∶1）；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：40 ℃ ；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10μL。理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

3.2 溶液制備

3.2.1 供試品溶液的制備 精密量取手足口合劑5 mL，置100 mL量瓶中，加稀乙醇（按照《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄配制）適量，超聲處理30 min，放冷至室溫，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，即為供試品溶液。

3.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取經(jīng)干燥后的黃芩苷對(duì)照品2.25 mg，置50 mL量瓶中，加入稀乙醇30 mL，置超聲波清洗器中超聲15 min使溶解，取出，放冷，用稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，得濃度45μg/mL的黃芩苷對(duì)照品溶液。

3.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 根據(jù)處方比例，稱(chēng)取除黃芩外的其余藥材，按合劑的制備工藝制成無(wú)黃芩的陰性樣品，再按照供試品溶液的制備方法，制成陰性對(duì)照溶液。

3.2.4 專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn) 分別吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液，分別按照上述色譜條件進(jìn)樣，記錄3份溶液的色譜圖，見(jiàn)圖5。結(jié)果表明，供試品溶液與對(duì)照品溶液在相同保留時(shí)間處有一黃芩苷峰色譜峰，而陰性對(duì)照溶液在該處未出現(xiàn)色譜峰，對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。理論塔板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算均大于5000；分離度符合要求。

3.3 線性關(guān)系考察 分別精密量取黃芩苷對(duì)照品溶液（45 μg/mL）6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0 μL，依次注入高效液相色譜儀，按照上述色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定各自峰面積。以對(duì)照品的進(jìn)樣量X（μg）為橫坐標(biāo)，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，得黃芩苷的回歸方程為：Y贊=2849744.13X-13379，r=0.99996，表明黃芩苷進(jìn)樣量在 0.270～0.720 μg 范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

3.4 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取黃芩苷對(duì)照品溶液10μL注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，按照上述色譜條件分析，測(cè)定峰面積，測(cè)得黃芩苷平均峰面積為1267629.3，RSD為0.30%，表明儀器精密度良好。

3.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取手足口合劑樣品（20111101）適量，共6份，按照文中3.2.1方法制備供試品溶液并測(cè)定，計(jì)算樣品含量。結(jié)果測(cè)得樣品中黃芩苷平均含量為1.249 mg/mL（RSD=0.46%），表明方法的重復(fù)性良好。

3.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中第1號(hào)供試品溶液 10 μL，分別在 0、2、4、6、8、10 h 進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得黃芩苷平均峰面積為1758688（RSD=0.51%），表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密量取2.5 mL手足口合劑樣品（20111101）6份，分別置100 mL量瓶中；再加入濃度為0.1210 mg/mL的黃芩苷稀乙醇溶液10 mL，按文中3.2.1方法處理，制得供加樣回收試驗(yàn)用供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果黃芩苷的平均加樣回收率為100.8%（n=6），RSD=1.11%。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 黃芩苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery testmg

3.8 樣品測(cè)定 取3批手足口合劑樣品（批號(hào)為20111101、20111102、20111201），按上述供試品溶液制備方法操作，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣10 μL測(cè)得樣品中黃芩苷含量分別為：1.249、1.258、1.237 mg/mL。

4 討論

黃芩、黃連、梔子、蒲公英、黃柏為本方中主藥，故對(duì)此5種藥進(jìn)行定性鑒別，在制訂薄層鑒別方法時(shí)，從樣品制備、展開(kāi)劑組成及比例的選擇、點(diǎn)樣量等方面，對(duì)幾味藥材的薄層色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，參考相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道[6-8]，選擇了最佳的實(shí)驗(yàn)條件，方法簡(jiǎn)單、可靠。

蒲公英的鑒別，筆者曾參考文獻(xiàn)報(bào)道[8]，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶2∶1）為展開(kāi)劑，樣品溶液中各組分的分離度不理想，最終選用乙酸丁酯-甲酸-水（7∶2.5∶2.5）的上層溶液為展開(kāi)劑,取得良好的分離效果。

黃柏與黃連的鑒別中，曾以正丁醇-冰醋酸-水（7∶1∶2）為展開(kāi)劑[9-10]，也曾選用甲苯-異丙醇-乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液（12∶3∶6∶3∶1）為展開(kāi)劑，另槽中加入等體積的濃氨試液，預(yù)飽和15 min后，進(jìn)行展開(kāi)，最終確定以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10∶6∶1∶1）為展開(kāi)劑，無(wú)論在展開(kāi)速度、分離效果以及環(huán)保等方面都略勝一籌。

黃芩作為該制劑的君藥，對(duì)其主要活性成分黃芩苷進(jìn)行含量測(cè)定，能夠準(zhǔn)確的反映制劑制備過(guò)程中工藝的完成情況，從而有效地控制產(chǎn)品質(zhì)量。黃芩苷極性較大，可均一、穩(wěn)定地溶解于水中，考慮到成品制劑工藝中無(wú)醇沉步驟，不宜使用稀醇溶液進(jìn)行稀釋?zhuān)蚀_定用水直接稀釋定容后測(cè)定黃芩苷含量。該方法經(jīng)濟(jì)、環(huán)保，而且滿足定量分析準(zhǔn)確度的要求。

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